Specific Calcium and Abscisic Acid Regulation of Anion Channels in Arabidopsis Guard Cells

Knowledge of the molecular mechanisms mediating responses of plants to drought conditions are of highest significance in times of a rapidly growing world population accompanied with an increasingly scarce supply of fresh water. Plant guard cells represent a single cell type controlling evaporative water loss and uptake of CO2 and are subject to intensive research. The plant hormone abscisic acid (ABA) accumulates in leaves during drought stress and leads to stomatal closure, representing a crucial protective mechanism to prevent excessive water loss. Within the last >15 years many aspects and proteins involved in this ABA-dependent closing mechanism have been determined resulting in guard cells being a model cell type for signal transduction research in plants. The gene for the S-type anion channel, SLAC1, of which activation is an essential step in fast stomatal closure, has been identified. Several proteins are phosphorylating and activating SLAC1 with free cytosolic Ca2+ playing an important role here. This activation is inhibited by protein phosphatases. In the presence of ABA these phosphatase are negatively regulated mediated by ABA-receptor proteins. However, many mechanistic details are still unknown. For example, whether the above mentioned protein components are sufficient for a functional reconstitution of the signal transduction pathway is not known. Moreover, the mechanism explaining how Ca2+-signaling specificity is achieved and how Ca2+-dependent and Ca2+-independent signaling branches are functionally linked is still unclear. In this work, besides the calcium dependent protein kinases (CPKs) already known to be involved in guard cell S-type anion activation mediated by SLAC1, two novel CPKs, CPK5 and CPK6, were identified to activate SLAC1. A quadruple knock out mutant including CPK5 and CPK6 was established and patch clamp analysis revealed that ABA- and Ca2+-dependent S-type anion current activation is abrogated in this mutant. Several aspects of CPK6-mediated SLAC1 activation, including identification of the phosphorylated residue responsible for the activation, kinase and channel phosphorylation affinities, the Ca2+-dependency of CPK6 activity, the regulatory role of PP2C phosphatases, and the functional reconstitution of the entire signal transduction pathway are presented. Furthermore, biochemical, genetic, and cell biology tools were used to reveal the molecular mechanism of how specificity in Ca2+- and ABA-dependent signal transduction mediated by PP2C phosphatases is achieved. Also, the presented results suggest that the functional dependence of Ca2+-dependent and Ca2+-independent ABA signaling branches is due to differential phosphorylation of SLAC1, synergistically integrating these two branches of ABA signal transduction. These results help to understand the tight control of ABA-dependent stomatal closure, a mechanism essential for plant survival during drought conditions.In Zeiten einer stark wachsenden Weltbevölkerung bei gleichzeitiger Süswasserknappheit, ist das Verständnis von Mechanismen die erklären, wie Pflanzen sich vor Austrocknung schützen, von höchstem Interesse. Pflanzliche Schließzellen, welche Spaltöffnungen umschließen, sind verantwortlich für die Regulation der Aufnahme von CO2 bei gleichzeitigem Verlust von Wasser und werden deshalb intensiv erforscht. Unter Trockenstress reichert sich das Pflanzenhormon Abscisinsäure (ABA) in Blättern an und führt zu dem Schluss der Spaltöffnung, um Pflanzung vor übermäßigen Verlust von Wasser zu schützen. Innerhalb der letzten >15 Jahre wurden viele Aspekte und Proteine, die eine wichtige Rolle im ABA-induzierten Schluss der Spaltöffnung spielen, identifiziert, weshalb sich Schließzellen zu einem Modellzelltyp für pflanzliche Signaltransduktionsforschung entwickelten. Das Gen des S-typ Anionkanals, SLAC1, der eine sehr wichtige Rolle im schnellen Schluss der Stomata spielt, wurde identifiziert. SLAC1 wird von mehreren Kinase phosphoryliert und aktiviert. Zytosolische Kalziumerhöhungen sind während dieser Aktivierung sehr wichtig. Diese Aktivierung wiederum wird negativ durch Protein Phosphatasen reguliert, welche durch ABA, in Kombination mit ABA Rezeptorproteinen, inhibiert werden. Viele mechanistische Details sind aber bis heute aber noch nicht verstanden. Der Mechanismus, wie spezifische Antworten auf eine zytosolische Kalziumerhöhung erreicht werden, ist noch nicht bekannt. Außerdem ist noch unklar, wie der Ca2+-abhängige und der Ca2+-unabhängigen Zweig der S-typ Anionenkanal Aktivierung interagieren. Neben den schon bekannten Kalzium abhängigen Proteinkinasen (CPKs), wird in dieser Arbeit gezeigt, dass zwei weitere CPKs, CPK5 und CPK6, SLAC1 aktivieren und phosphorylieren. Patch clamp Experimente einer vierfach Mutante, in der die Transkription von vier CPKs, einschließlich CPK5 und CPK6, verhindert ist, zeigt dass ABA und Ca2+ Applikation nicht mehr zu der Aktivierung von S-Typ Anionenkanälen führt. Mechanistische details der CPK Aktivierung von SLAC1 einschließlich der Identifikation einer funktionell wichtigen phosphorylierten Aminosäure, die Affinität der Phosphorylierung von SLAC1 durch mehrere Kinasen, die Ca2+-Abhängigkeit der CPK6 Aktivität, die regulatorische Funktion der Protein Phosphatasen, und eine Rekonstitution des gesamten ABA Signaltransduktionswegs werden in dieser Arbeit präsentiert. Unter Berücksichtigung dieser Resultate und unter Benutzung biochemischer, zellbiologischer und genetischer Methoden konnte ein Mechanismus gefunden werden, der erklärt wie zytosolische Ca2+ Erhöhungen zu einer spezifischen Antwort innerhalb des ABA-abhängigen Schlusses der Spaltöffnung führen. Außerdem deuten Ergebnisse darauf hin, dass die Interaktion der Ca2+-abhängigen und -unabhängigen S-Typ Anionenkanal Aktivierung darauf beruht, dass SLAC1 differentiell von Kinasen dieser Zweige phosphoryliert und synergistisch aktiviert wird