Characterzation of a delta rodA mutant in Staphylococcus carnosus

Bakterien können in einer Vielzahl von Formen erscheinen. Manche sind stäbchenförmig, manche geformt wie Spiralen andere bilden Filamente oder sogar komplizierte pilzartige Geflechte. Formgebend ist in Bakterien vor allem die Anordnung ihrer Zellwand dem sogenannten Murein oder Peptidoglykan, einer rigiden polymeren extrazellulären Struktur. Staphylokokken sind wie bereits in ihrem Name beschrieben, kleine kugelförmige Bakterien, die sich in Clustern anordnen können. Trotz seiner vergleichsweise einfachen Form besitzt das nicht pathogene Bakterium Staphylococcus carnosus drei Proteine, welche in stäbchenförmigen Bakterien mit dem Erhalt der Zylinderform des Mureins assoziiert werden. Das Ziel der Arbeit war es diese sogenannten SEDS-Proteine (steht für shape elongation division and sporulation, also Form, Längenwachstum, Teilung und Sporenbildung) auf ihrer Funktion hin zu untersuchen. Von jedem der 3 in S. carnosus annotierten Gene (ftsW1, ftsW2, rodA) wurden Deletionsmutanten angefertigt und diese wurden biochemisch und morphologisch charakterisiert. Unter den getesteten Bedingungen, welche den Standardbedingungen im Labor entsprachen, zeigte lediglich die Deletion von rodA eine eindeutige phänotypische Veränderung gegenüber dem Wildtyp Stamm. Die Wachstumsrate war verändert mit einer verkürzten lag-Phase und einem niedrigeren Endniveau. Diese Beobachtung und die frühzeitige, spontane Lyse des Mutanten-Stamms ließen darauf schließen, dass es auch Veränderungen in der Zellwand der Mutante gegeben hat. Lichtmikroskopische Untersuchungen der Zellen waren genauso wie die elektronenmikroskopischen unauffällig. Erst als mit fluoreszenzmikroskopischen Methoden der genaue Ort der Murein-Biosynthese sichtbar gemacht wurde, konnten Unterschiede in Form von einer diffusen statt septalen Verteilung des neu synthetisierten Mureins ausgemacht werden. Dies bestätigte sich nochmal durch Anwenden hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie. Des Weiteren wurde das Murein bzw. dessen Zusammensetzung biochemisch und chromatographisch untersucht. Murein besteht aus den zwei alternierenden Zucker N-Acetyl-Glukosamin und N-Acetyl-Muraminsäure, die ß-(1,4) glykosidisch verknüpft sind. Angehängt an die Muraminsäure ist eine Peptid-Kette mit 3 bis 5 Aminosäure, welche in S. carnosus wiederrum über eine aus 5 Glyzinen bestehende Interpeptid-Brücke quervernetzt sein können. Man erhält durch Verdau mit dem Enzym Mutanolysin und Auftrennung über einer HPLC ein typisches Muropeptid-Muster, welches im Falle der Mutante eindeutig zu längeren Retentionszeiten verschoben war. Massenspektrometrische Analysen offenbarten den Einbau der Aminosäure Serin in die Muropeptide der Mutante. Diese ist nicht ungewöhnlich für Bakterien, zeigt aber, inwiefern die Deletion die Zellen beeinflusst. Zur Bestätigung dieses Fundes wurden die Aminosäuren der Stammpeptide des Mureins mit einer eigens dafür etablierten Methode untersucht, sowie eine zweite besser auflösende Massenspektrometrie durchgeführt. In beiden Fällen waren die Ergebnisse positiv für den Einbau von Serin in das Murein der Mutante. Eine weitere Auffälligkeit aus der Massenspektrometrie, nämlich das vermehrte Vorkommen von Tripeptiden, Mureinuntereinheiten mit lediglich drei Aminosäuren im Stammpeptid, und deren Abwesenheit in der Mutante führte zu dem Schluss, dass die Modifikation, die im Wild typ S. carnosus TM300 noch durchgeführt werden kann, in der rodA Deletion gestört ist. Das Enzym, das vermutlich für diese Modifikation verantwortlich ist, nennt man L, D-Carboxypeptidase und ist nur für zwei Staphylokokken Spezies annotiert, neben S. carnosus auch noch in S. pseudointermidies. Dies erklärt zum einem den Unterschied im Murein-Muster von S. aureus SA113 WT, der dieses Enzym nicht besitzt, zu S. carnosus TM300 zum anderen scheint in der rodA Deletion die Funktion des Enzyms beeinträchtigt zu sein, sei es durch den vermehrten Einbau von Serin, durch eine fehlende Aktivierung durch RodA oder durch fehlerhafte Lokalisation