Binding and effect of KATP channel modulators

1ATP-sensitive K+-Kanäle (KATP-Kanäle) sind Heterooktamere aus vier porenbildenden Untereinheiten Kir (2 Subtypen: Kir6.1 und Kir6.2) und vier regulatorischen Untereinheiten SUR (2 Subtypen: SUR1 und SUR2 mit zwei Hauptspleißvarianten 2A und 2B). Sie kommen, unterschiedlich zusammensetzt, in vielen Geweben (z. B. Kir6.2/SUR1 in beta-Zellen des Pankreas, Kir6.2/SUR2A im Myokard, Kir6.1/SUR2B im glatten Gefäßmuskel) vor und regulieren dort wichtige physiologische Funktionen. Sie sind Zielstrukturen für pharmakologische Modulatoren wie die Kanal-Blocker (Sulfonylharnstoffe und Glinide) und Öffner (z.B. Bimakalim). In dieser Arbeit wurden folgende Schwerpunkte bearbeitet: Die Selektivität von Sulfonylharnstoffen (SU) und Gliniden in Bindung und Wirkung für die drei wichtigsten KATP-Kanalsubtypen Kir6.2/SUR1 (Pankreas), Kir6.2/SUR2A (Myokard) und Kir6.1/SUR2B (Gefäß) Der Einfluss der Koexpression mit Kir6.x auf die Bindung von SU und Gliniden an SUR1 Der Einfluss der Mutation Y1206S und der Koexpression mit Kir6.x auf den Sulfonylharnstoffrezeptor SUR2A Der Zugang der KATP-Kanal-Öffner vom Benzopyrantyp an ihre Bindungsstelle Die Affinität ausgewählter SU und Glinide zu den rekombinanten Kir6.2/SUR1- und Kir6.2/SUR2A-Kanälen wurde mittels Verdrängung des 3H-Glibenclamids (3H-GBC) an intakten HEK-Zellen bei 37ºC bestimmt. Dabei wurden keine nennenswerten Unterschiede in der Selektivität zwischen den reinen A-Liganden (kurzkettiger SU Glibornurid und das D-Phenylalanin-Derivat Nateglinid) und den A+B-Liganden (langkettige SU: GBC, Glimepirid) beobachtet. Beide Ligandklassen banden ~19-fach stärker an den pankreatischen als an den kardialen Kanal. Repaglinid, AZ-DF265, Meglitinid und UL-DF9 (reine B-Liganden) zeigten nur eine stark reduzierte Pankreas- (Repaglinid, AZ-DF265) oder gar eine leichte Herz-Selektivität (Meglitinid, UL-DF9). Die Wirkung von Repaglinid und GBC auf die KATP-Kanäle des Pankreas, Myokards und Gefäßes wurde in der Ganzzellkonfiguration der Saugelektrodentechnik bei 37ºC untersucht. Der pankreatische Kanal wurde von Repaglinid >=30- und von GBC >=1000-fach potenter gehemmt als die kardiovaskulären Kanäle. Darüber hinaus wurde der myokardiale Kanal von beiden Substanzen nur unvollständig geschlossen. Die Umsetzung der Bindung in die Kanalschließung vollzog sich am leichtesten am pankreatischen Kanal. Die hier vorgestellte Pankreas-Selektivität von GBC und Repaglinid spricht für deren therapeutische Sicherheit, die jedoch nur in geeigneten klinischen Studien endgültig belegt werden kann. Die Untersuchung des Einflusses der Kanalkomplexbildung zwischen Kir6.x und SUR auf die Bindung von SU und Gliniden zeigte, dass Koexpression mit Kir6.x die Affinität von Repaglinid und AZ-DF265 zum pankreatischen SUR (SUR1) sehr stark (>100-fach), die der restlichen Kanal-Blocker dagegen nur gering (<5-fach) erhöhte. Dieses Verhalten beruht auf der Piperidino-Gruppe und trägt entscheidend zur Pankreas-Selektivität der beiden B-Liganden bei. Ferner ist ein intakter N-Terminus des Kir für diesen Koexpressionseffekt essentiell. Die Bindungseigenschaften des kardialen SUR2A wurden in dieser Arbeit als weiterer Schwerpunkt untersucht. Besonderes Interesse galt dabei dem Einfluss der SUR2A-Mutation Y1206S (bei der Y1206 durch S ersetzt ist, die entsprechende Aminosäure im SUR1) und der Koexpression mit Kir6.x auf die Modulator-Bindung. Am vollständigen Herzkanal exprimiert in intakten HEK-Zellen verbesserte die Y1206S-Mutation die Bindung der A- und A+B-Liganden ~13-fach. Die B-Liganden Meglitinid und UL-DF9 verloren leicht an Bindungsstärke. Die Koexpression mit Kir6.2 erhöhte die Affinität aller untersuchten SU und Glinide, am stärksten die von AZ-DF265 und Repaglinid. Die Sonderstellung der Piperidino-Glinide fiel hier jedoch geringer aus als am SUR1. Die Affinität des KATP-Kanal-Öffners P1075 zum SUR2A wurde durch die Mutation Y1206S und die Koexpression mit Kir6.2 nicht verändert bzw. geringfügig reduziert. Die negativ allosterische Kopplung der GBC- und P1075-Bindungsstellen am SUR2 wurde sowohl durch die Y1206S-Mutation, als auch durch die Koexpression mit Kir6.2 wesentlich verändert. Im letzten Teil wurde untersucht, ob die KATP-Kanalöffner von der intra- oder extrazellulären Seite her an Kir6.2/SUR2B (KATP-Kanal der glatten nicht vaskulären Muskulatur) binden. Dazu wurden Bindung und Wirkung von zwei Benzopyranen, der negativ geladenen, schlecht membrangängigen Bimakalimsulfonsäure (BMSA) und der ungeladenen Muttersubstanz Bimakalim verglichen. Während Bimakalim den Radioliganden 3H-P1075 in Membran- und Ganzzellversuchen mit ähnlicher Affinität verdrängte (Ki = 61 bzw. 35 nM), band BMSA nur in Membranen, nicht aber in intakten Zellen mit hoher Affinität (4,3 vs. 186 µM). Ferner aktivierte Bimakalim den Kanal in allen verwendeten Patch-clamp-Konfigurationen (whole-cell inside-out, cell-attached), BMSA hingegen nur nach Applikation auf die zytoplasmatische Seite der Zellmembran in Inside-out-Patch. Dies zeigt, dass KATP-Kanal-Öffner vom Benzopyrantyp ihre Bindungsregion am SUR vom Zytosol aus erreichen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen zur Aufklärung der Struktur-Bindungs- und Struktur-Wirkungs-Beziehungen von KATP-Kanal-Modulatoren bei. Vor allem die Erkenntnisse über die Selektivität der untersuchten SU und Glinide haben auch klinische Relevanz.1ATP-sensitive K+-channels (KATP channels) are heterooctamers composed of four poreforming subunits Kir (2 subtypes, Kir6.1 and Kir6.2) and four regulatory subunits SUR (2 subtypes, SUR1 and SUR2 with two splice-variants 2A and 2B). In different subunit-composition they are present in various tissues (e.g. Kir6.2/SUR1 in pancreatic beta-cells, Kir6.2/SUR2A in cardiac myocytes, Kir6.1/SUR2B in vascular smooth muscle cells) and regulate important physiological functions. They are also targets of synthetic drugs such as the sulfonylureas (SUs) and glinides (collectively termed insulinotropes) which close those channels and the channel openers (e.g. bimakalim). In this work four main issues were investigated: Selectivity of selected insulinotropes in binding to and closing of the pancreatic as compared to the cardiovascular KATP channels. Effect of coexpression with Kir6.x on the binding affinity of insulinotropes for the pancreatic SUR (SUR1). Impact of the mutation Y1206S and of coexpression with Kir6.x on the binding properties of the cardiac SUR (SUR2A). Access of benzopyran-type KATP openers to their binding site on the non-vascular smooth muscle KATP channel Kir6.2/SUR2B. In order to assess the binding selectivity of insulinotropes, 3H-glibenclamide (3H-GBC) binding compe­tition experiments were conducted in intact HEK cells expressing the pancreatic or the cardiac channel at 37ºC. There was no difference in selectivity between A-ligands (short chain SU glibornuride and nateglinide, a D-phenylalanine derivative) and A+B-ligands (long chain SUs: glibenclamide, glimepiride). Both ligand classes bound with ~19x higher affinity to the pancreatic than to the myocardial channel. The B-ligands, repaglinide, AZ-DF265, meglitinide and UL-DF9 showed either a strongly reduced selectivity for the pancreatic channel (repaglinide, AZ-DF265), or a slight cardioselectivity (meglitinide, UL-DF9). The effects of repaglinide and glibenclamide on the pancreatic, myocardial and vascular KATP channels were investigated in the whole-cell-configuration of the patch-clamp-technique at 37ºC. Repaglinide and glibenclamide were >=30 and >=1000 times more potent in closing the pancreatic than the cardiovascular channels, respectively, and they did not induce complete inhibition of the myocardial channel. The transduction of inhibitor binding into channel closure was easiest for the Kir6.2/SUR1 channel. The selectivity of repaglinide and glibenclamide shown here supports their therapeutical safety. However, these conclusions must be confirmed in appropriate clinical studies. Investigating the effects of coexpression with Kir6.x on the affinity of insulinotropes binding to SURx we found that this greatly (>100x) enhanced the affinity of repaglinide and AZ-DF265 for SUR1, whereas the effect was small for other SUs and glinides (