Oligomerisierung des Ammoniumtransporters LeAMT1;1 und seine Interaktionen mit anderen Proteinen

Ammonium is one of the important nitrogen sources for plant growth and development. Ammonium uptake and retrieval mediated by high-affinity ammonium transporters at the plasma membrane is the initial step in ammonium assimilation and nitrogen metabolism. Molecular and genetic studies have revealed a large protein family of ammonium transporters functionally diverse but evolutionarily conserved in all domains of organisms. Despite the available information regarding the physiological aspects, biochemical characteristics and gene regulations of ammonium transporters, the function of the transporter proteins is still poorly understood, and the sensory/regulatory mechanism coupling ammonium transport in plants remains elusive. To test the hypothesis that plant ammonium transporters form multimeric complexes at the plasma membrane, the well-characterized plant ammonium transporters LeAMT1;1 and LeAMT1;2 from tomato were used as a model system. Protein-protein interactions between these transporters were monitored in two in vivo systems: the split ubiquitin system and the Xenopus oocyte expression system. Results firmly demonstrate that plant ammonium transporters, at least in the case of the LeAMT1;1 and LeAMT1;2, exist in homo-oligomeric forms. A dominant-negative point mutation at the conserved cytoplasmic C-termini of the LeAMT proteins, corresponding to the reported inhibitory mep1-1 mutation in the yeast ammonium transporter Mep1, was characterized. It is non-functional in both yeast and oocytes and specifically reduces the activity of co-expressed wild-type LeAMT proteins in oocytes in a dominant negative manner. These results demonstrate that LeAMT1;1 and LeAMT1;2 form not only homo- but also hetero-oligomeric structures. GFP-fusion of LeAMT1;1 indicates that this mutation does not impair the subcellular localization of the transporter. Taken together, these results suggest that oligomerization of the transporter proteins is necessary for maintaining an efficient transport of the substrate across the plasma membrane. Stable transgenic lines of tomato were generated to over-express the wild type and the mutant genes under the 35S promoter. These transgenic lines facilitate further analysis of the physiological effects of the dominant-negative mutant of LeAMT1;1. By screening yeast two-hybrid libraries with the C-terminal cytoplasmic fragment of LeAMT1;1 as a bait, putative interacting proteins were identified. One cDNA was isolated three-times independently and encodes a polypeptide that maps to the C2 domain of a plant phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC). Plant PI-PLC has been found participating in a number of cellular signal transduction pathways in response to environmental stimulus. The possible roles underlying the putative interaction between LeAMT1;1 and the tomato PI-PLC cDNA, in terms of the ammonium sensory and signaling network in plants, is discussed. The identification of a plant PI-PLC as a putative interaction partner of LeAMT1;1 will initiate further investigations in this area.Ammonium ist eine der wichtigen Stickstoffquellen und spielt eine zentrale Rolle für das Wachstum und Entwicklung der Pflanzen. Die Aufnahme von Ammonium durch hoch-affine Transporter in der zellulären Plasmamembran stellt den ersten Schritt der Stickstoffassimilation sowie des Stickstoffmetabolismus dar. Molekulare und genetische Studien zeigen eine Superfamilie von Ammoniumtransportern und Ammoniumtransporter-ähnlichen Proteinen aus allen bekannten phylogenetischen Domänen des Lebens. Trotz der vielen Informationen über die physiologischen und biochemischen Charakteristika, sowie die Expressionsregulation der Transporter, bleibt der genaue Funktionsmechanismus der pflanzlichen Transporterproteine weitestgehend unerforscht. Ebenfalls unbekannt ist wie Ammoniumtransporter in Pflanzen durch das Stickstoffangebot reguliert werden. Ob pflanzliche Ammoniumtransporter in der Plasmamembran als multimere Komplexe vorliegen können, war die erste Fragestellung die es zu untersuchen galt. Hierzu wurden die bisher am weitesten charakterisierten LeAMT1;1 und LeAMT1;2, aus der Tomate stammend, als Modelsystem gewählt. Die Protein-Protein Interaktionen zwischen diesen Transportern wurden mit Hilfe von zwei in vivo Systemen untersucht: dem Split Ubiquitin System und durch Expressionsstudien in Xenopus Oocyten. Die Ergebnisse zeigen, dass zumindest im Falle von LeAMT1;1 und LeAMT1;2, pflanzliche Ammoniumtransporter Homooligomere bilden können. Als nächstes wurde der Einfluss einer Punktmutation im konservierten C-terminalen Bereich von LeAMT Proteinen auf den Transport untersucht. Es ist bekannt, dass eine entsprechende Punktmutation "mep1-1" des Hefetransporters Mep1 einen dominant-negativen Effekt auf den Ammoniumtransport ausübt. Die Punktmutationen von LeAMT1;1 und LeAMT1;2 führten zur Inhibition ihrer Transporteraktivität, wie durch Hefekomplementation und Expression in Xenopus Oocyten gezeigt werden konnte. Die Co-Expression von Punktmutanten mit den Wildtyp LeAMTs in Xenopus Oocyten führte zu einer spezifischen Reduktion des Ammoniumtransports. Diese Ergebnisse zeigen, dass LeAMT1;1 und LeAMT1;2 nicht nur homo- sondern auch heteromere Komplexe bilden können. Versuche mit GFP Fusionen sprechen dafür, dass die Punktmutation die subzelluläre Lokalisierung der LeAMTs nicht beeinträchtigt. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse die Vermutung nahe, dass die Oligomerisierung von LeAMT Transportern für einen effizienten Transport des Ammoniums durch die Plasmamembran wichtig sein könnte. Stabile, transgene Tomatenlinien, welche den Wildtyp und die Punktmutante von LeAMT1;1 unter Kontrolle des konstitutiven 35S Promotors exprimieren, wurden hergestellt. Diese Linien ermöglichen die physiologischen Effekte der dominant-negativen Punktmutation von LeAMT1;1 bezüglich der Pflanze zu charakterisieren. Durch "Screening" von "Yeast-two-hybrid" cDNA Bibliotheken mit dem cytoplasmatischen C-terminus von LeAMT1;1 wurden mögliche interagierende Partner von LeAMT1;1 gesucht und identifiziert. Mehrere unabhängig isolierte cDNA Klone kodierten für die C2 Domäne der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) aus Pflanzen. Pflanzliche PI-PLCs sind an der Signalübertragung verschiedener extra- und intrazellulärer Stimuli beteiligt. Mögliche Bedeutung der Interaktion von LeAMT1;1 und PI-PLC bezüglich der Funktion von LeAMT1;1 als Stickstoffsensor, sowie die damit verbundenen Signalübertragungswege werden diskutiert. Die Identifizierung von PI-PLC als möglichen Interaktionspartner von LeAMT1;1 eröffnet die Möglichkeit zu weiterführenden Studien auf diesem Gebiet