Evaluation of kinase inhibitors for the treatment of the hepatoblastoma

Das Hepatoblastom ist der am häufigsten vorkommende bösartige Lebertumor im Kleinkindalter und in der Kindheit. Er stellt ca. 1 % der bösartigen Kindertumore dar und hat im fortgeschrittenen Stadium eine schlechte Prognose. Ein sehr großes Problem ist die Entwicklung von Resistenzen gegenüber klassischen Zytostatika. Aufgrund ihrer potentiellen zytostatischen und zytotoxischen Wirkung stellen Modulatoren der Kinasesignalübermittlung einen vielversprechenden Ansatz in der Tumortherapie dar. Ziel der vorliegenden Untersuchung war die Analyse der antineoplastischen Wirkung der Kinase-Inhibitoren VX-680, Wee1-InhibitorII und SU11274 auf HB-Zellen der Linien HepT1 und HuH6. VX-680 und Wee1-InhibitorII wurden sowohl einzeln als auch in Kombination mit dem Chemotherapeutikum CDDP mit den Zelllinien inkubiert. VX-680 wurde zusätzlich in der Kombination mit dem Histon-Deacetylase-Inhibitor SAHA evaluiert. In Proliferationsassays konnte der stärkste proliferationshemmende Effekt auf HB-Zellen für VX-680 dokumentiert werden. Es zeigte sich, dass HuH6-Zellen deutlich sensibler auf den Aurorakinase-Inhibitor reagierten als HepT1-Zellen. Der IC50-Wert wurde für HuH6 mit 8 µM und bei HepT1 mit 16,6 µM bestimmt. Während VX-680 zu keiner additiven Proliferationshemmung von CDDP beitrug, zeigte sich bei gesteigerter Dephosphorylierung und vermehrter Acetylierung mit VX-680 und SAHA eine synergistische Wirkung auf den proliferationshemmenden Effekt bei HuH6-Zellen. Die Inhibition mit VX-680 führt zu einem Anstieg apoptotischer Zellen und zu morphologischen Veränderungen wie Vakuolenbildung und einem Anschwellen der Zellen und Zellkerne. Mit Hilfe von Western Blot, Immunfluoreszenz und FACS Analyse ließ sich eine Abnahme der Phosphorylierung an Serinresten von Histon H3-Proteinen unter Einwirkung von VX-680 in HB-Zellen dokumentieren. Die Inkubation von HuH6-Zellen mit VX-680 führte zu einer Anreicherung von Tumorzellen mit Stammzellcharakter. In einem Modell zur Chemoresistenz (3D) konnten, im Vergleich zu 2D-Kulturen, keine wesentliche Proliferationsabnahme durch VX-680 und SAHA beobachtet werden. Unter den getesteten Kinase-Inhibitoren zeigte VX-680 eine spezifische Wirkung auf die Dephosphorylierung von Histon H3-Proteinen und zelluläre Effekte wie Proliferationshemmung, Zellschwellung und Apoptose¬induktion bei HB-Zellen. Die Wirkung von VX-680 bei resistenten Zellen und auf vermeintliche Tumorstammzellen deutet jedoch auf einen limitierten Nutzen des Kinase-Inhibitors für die Gruppe der therapierefraktären Hepatoblastome hin.The hepatoblastoma is the most common malign liver tumor in childhood. It represents about 1% of all malign childhood tumors and has got a poor prognosis in an advanced stage. A huge problem is the development of resistances against common cytostatic drugs. Because of the possible cytostatic and cytotoxic effects, modulators of the kinase signal transmission are a promising approach in tumor therapy. The objective of the following evaluation is the analysis of the antineoplastic effect of the kinase inhibitors VX-680, Wee1-InhibitorII and SU11274 on hepatoblastoma cells of the cell lines HepT1 and HuH6. The incubation of the cell lines with VX-680 and Wee1-InhibitorII was done individually as well as in combination with the cytostatic drug CDDP. VX-680 was additionally evaluated in combination with the Histone deacetylase inhibitor SAHA. The proliferation assays showed the strongest growth inhibition on HB cells for VX-680.It was evident that HuH6 cells respond far more sensible to the Aurora kinase inhibitor than HepT1 cells. The evaluated IC50 value for HuH6 was 8 µM and for HepT1 16,6µM. Although VX-680 didn’t enhance the proliferation inhibition of CDDP in combination with SAHA, VX-680 showed an increased dephosphorylation and acetylation and a synergistic effect on the inhibition of proliferation of HuH6 cells. Under the influence of VX-680 the number of apoptotic cells increased and morphological changes like the formation of vacuoles and the swelling of cells and cell cores were detected. By using Westernblot, Immunofluorescence and FACS analysis it was possible to document the decrease of phosphorylation of Serin at Histone H3 under the influence of VX-680. The incubation of HuH6 cells with VX-680 leads to an accumulation of tumor cells with the specific morphoplogy of stem cells. In an artificial model imitating chemo resistance ( 3 dimensional ) VX-680 and SAHA didn’t show hardly any inhibition of proliferation compared to the effect on normal cell cultures. Among the evaluated kinase inhibitors VX-680 showed specific effects on the dephosporylation of Histone H3 proteins and cellular effects like inhibition of the proliferation, cell swelling and induction of apoptosis at HB cells. The effect of VX-680 on resistant cells and assumed tumor stem cells indicates only a limited use of kinase inhibitors for the group of hepatoblastomas which are resistant to therapy