About the influence of Aggregation Substance and Binding Substance as well as metronidazole and cefotaxime on translocation of Enterococcus faecalis in T84 epithelial cell cultures

Enterococcus faecalis ist ein Bestandteil der residenten Flora des Darmes, aber auch Ursache für schwere nosokomiale Infektionen, darunter für bis zu 17% der Sepsisfälle. Einer der potentiell möglichen Wege auf dem Enterokokken in die Blutbahn gelangen ist, dass sie unter bestimmten Voraussetzungen die Darmwand durchwandern können. Mit dieser „bakteriellen Translokation“, beschäftigt sich diese Arbeit in einem In-Vitro-Modell. Dafür wurden die dem Colonepithel ähnlichen T84-Zellen verwendet. Zu den möglichen Virulenzfaktoren von E.faecalis wird das Oberflächenmolekül Aggregation Substance (AS) gezählt, das gemeinsam mit Binding Substance (BS) zu einer Verklumpungsreaktion führt, wodurch den Bakterien der Austausch von Plasmiden erleichtert wird. Der Einfluss von AS auf die Translokation wird in verschiedenen Studien unterschiedlich bewertet. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Oberflächenstrukturen auf die Adhärenz an T84-Zellen und die in T84-Zellen aufgenommenen Enterokokken untersucht. Man verwendete vier verschiedene Mutanten, die durch gentechnische Manipulation dahingehend verändert sind, dass sie entweder ausschließlich AS (INY3000 pINY1801) oder BS (OG1 SSp pWM401) an der Oberfläche exprimieren, oder beide zusammen (OG1 SSp pINY1801), oder gar keine dieser Strukturen (INY3000 pWM401). Die Ergebnisse zeigten eine signifikant erhöhte Adhärenz von Enterokokken, die AS besitzen (p<0,001). Die Translokation von Enterokokken des Phänotyps AS+BS+ in T84-Zellen war in dieser Arbeit verglichen zu anderen Phänotypen signifikant reduziert (p<0,0001). Dies steht im Widerspruch zu den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen. Die abweichenden Ergebnisse können möglicherweise durch ein anderes methodisches Vorgehen beim Entfernen der extrazellulären Bakterien erklärt werden. Durch die vermehrte Adhärenz AS-positiver Enterokokken werden diese unter Umständen nicht vollständig abgetötet. Dies wurde hier durch zusätzliche Arbeitsschritte vermieden. Die Rolle von AS bleibt weiterhin unklar. Anhand unserer Daten zeigen sich, zumindest an der Zellkultur, keine Hinweise auf eine verstärkte Translokation von E.faecalis die AS exprimieren, sondern eine signifikant reduzierte Aufnahme dieser Bakterien. Auch einigen Antibiotika wird eine Rolle als Risikofaktor für die Entstehung einer Enterokokkensepsis zugeschrieben. Man untersuchte einige dieser Substanzen auf ihren Einfluss auf die Translokation von E.faecalis 12030 in T84-Zellen. Verwendung fanden zunächst Metronidazol, Ceftriaxon, Cefoxitin, Cefotaxim, Amphotericin B, Ciprofloxacin und Meropenem. Gewählt wurden sie aufgrund ihrer häufigen Verwendung im klinischen Alltag und ihrer vermuteten Rolle als Risikofaktor. Unter Amphotericin B, Ciprofloxacin und Meropenem war das Wachstum von E.faecalis 12030 in vitro selbst in subinhibitorischen Konzentrationen so stark beeinträchtigt, dass sie in weiteren Versuchen nicht verwendet werden konnten. Trotz der natürlichen Resistenz von Enterokokken gegenüber Cephalosporinen, zeigte sich in vitro eine geringe Beeinträchtigung von E.faecalis 12030 durch Cefoxitin und Cefotaxim. Dann wurde das Wachstums von T84-Zellen unter Metronidazol, Cefotaxim, Cefoxitin, Ceftriaxon und Amphotericin B über sieben Tage beobachtet. Unter Amphotericin B starben die Zellen ab, weswegen es nicht weiter verwendet wurde. Im nächsten Schritt untersuchte man die Translokation unter dem Einfluss von Antibiotika. Man wählte aufgrund der obigen Ergebnisse Metronidazol und Cefotaxim, die in unterschiedlichen Konzentrationen zum Nährmedium der Zellen gegeben wurden. Während ohne Antibiotikum und mit Metronidazol im Medium die T84-Zellen gleich viele E.faecalis 12030 aufnahmen, zeigte sich unter Cefotaxim eine signifikant reduzierte Aufnahme. Somit konnte ein Einfluss von Cefotaxim auf T84-Zellen in ihrer Interaktion mit Enterokokken eindeutig nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnte die Translokation von Enterokokken in Darmepithelzellen in unserem In-Vitro-Modell gut reproduzierbar nachvollzogen werden. Es konnte gezeigt werden, dass auf das Ausmaß der Translokation sowohl bakterieneigene Faktoren (hier: Aggregationssubstanz), als auch exogene Faktoren – am Beispiel des Drittgenerationscephalosporins Cefotaxim – einen modulierenden Einfluss haben.Enterococcus faecalis is part of the indigenous human intestinal microflora, but may also cause severe nosocomial infections, most importantly up to 17% of cases of sepsis. Translocation through intestinal mucosa is thought to be an important pathway for enterococci to reach the human bloodstream. This dissertation works with an in-vitro model of bacterial translocation using T84 cell cultures, which are derived from human colon epithelial cells. Aggregation substance (AS) is classified as virulence factor in E. faecalis. This surface protein leads together with enterococcal binding substance (BS) to a clumping reaction, which enables the exchange of plasmids between enterococci. Conflicting results are reported in the literature concerning the influence of AS on the translocation process. In this dissertation thesis, we investigated the influence of AS and BS on adherence of enterococci at T84-cells and on intracellular uptake of enterococci in T84-cells. We used 4 different isogenic mutants of E. faecalis, which either exclusively express AS (INY3000 pINY1801) or BS (OG1 SSp pWM401) on their bacterial surface, or both factors together (OG1 SSp pINY1801), or none of these surface structures (INY3000 pWM401). Our results show significantly increased adherence of enterococci expressing AS (p < .001). Intracellular uptake of enterococci expressing the phenotype AS+BS+ was significantly reduced in comparison to the other phenotypes (p < .0001). This result is different from the results of other groups investigating the role of AS on enterococcal translocation. The differences can most likely be explained by different methodological approach when excluding extracellular adherent bacteria. Since AS-positive enterococci have increased adherence to T84-cells, it is more difficult to completely kill the adherent bacteria before the intracellularly remaining bacteria are determined by lysis of the T84-cells. In our experiments, we used additional steps in order to completely eliminate extracellular adherent bacteria. The role of AS in human infections remains to be determined. Our data using intenstinal cell cultures do not show increased translocation of enterococci expressing AS, since there is reduced intracellular uptake. According to epidemiological and clinical data, some antibiotics are also thought to be risk factors for enterococcal sepsis. We therefore investigated the influence of different antibiotics on the translocation of E. faecalis 12030 in T84-cells. We used metronidazol, ceftriaxone, cefoxitine, cefotaxime, ciprofloxacin, meropenem, and amphotericin B. These antibiotics were chosen according to data from the literature showing their possible role as risk factors. Amphotericin B, ciprofloxacin, and meropenem inhibited growth of E. faecalis and were not further investigated. Despite their intrinsic cephalosporin resistance, there was growth inhibition of E. faecalis 12030 by cefoxitine and by ceftriaxone. Then, we investigated growth of T84-cells under in the presence of metronidazol, cefotaxime, cefoxitine, ceftriaxone, and amphotericin B over 7 days. Amphotericin B inhibited growth of T84-cells and was not further investigated. The next step was to investigate translocation of E. faecalis under the influence of antibiotics. With respect to the results reported above, we used metronidazol and cefotaxime, which were added at different concentrations to the growth media. The main results were that metronidazol had no influence on intracellular uptake of E. faecalis 12030 compared to control experiments without antibiotics. In contrast, cefotaxime significantly and dose-dependently reduced intracellular uptake of E. faecalis. This proves significant interaction of cefotaxime with enterococci in our cell culture model. In summary, we were able to show translocation of enterococci in our in-vitro model using T84 intestinal epithelial cells. Furthermore, we showed that the magnitude of intracellular uptake may be modulated by bacterial factors (in our experiments: AS), but also by exogenous factors (in our experiments the third-genration cephalosporin cefotaxime)