Characterisation of the cytoplasmatic Ca2+-increase in renin secreting cells of the rat kidney, caused by ANG II

Hypertonie ist heute eine wichtige medizinische Problematik. Äthiologisch ist das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ein zentraler Mechanismus in der Entstehung des hohen Blutdrucks. Renin wird hauptsächlich von den juxtaglomerulären Zellen der Niere in die Blutbahn sezerniert (RSZ). Dies stellt den aktivitätsbestimmenden Schritt im RAAS dar. Die regulatorischen Mechanismen der Reninfreisetzung sind bislang nur unvollständig aufgeklärt und könnten bei Aufklärung einen Ansatzpunkt für neue Medikamente in der Hypertonietherapie bedeuten. Wichtigster first messenger dieses Systems ist Angiotensin II (ANG II), welches über einen negativen Feedbackmechanismus die Reninfreisetzung hemmt. Wichtige second messenger sind die cytoplasmatische cAMP-Konzentration und die freie cytoplasmatische Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i). Intrazelluläres Ca2+ bewirkt eine Hemmung, intrazelluläres cAMP eine Steigerung der Reninsekretion. Die Reninsekretion wird zusätzlich durch die extrazelluläre Osmolarität beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurde die [Ca2+]i in RSZ der Rattenniere mit der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie untersucht. ANG II verursacht in diesen Zellen einen Anstieg der [Ca2+]i. Dieses Signal kann in zwei unterschiedliche Phasen eingeteilt werden, einen steilen Anstieg mit anschließendem Abfall (Peakphase) und eine Phase mit konstant erhöhten [Ca2+]i-Werten (Plateauphase). Welche Ca2+-Kanäle und Kompartimente für die unterschiedlichen Phasen dieses Ca2+-Signals verantwortlich sind, ist bislang nicht vollständig geklärt und war Kernpunkt meiner Arbeit. RSZ werden durch ANG II depolarisiert. Dennoch sind die vorhandenen spannungsaktivierten Ca2+-Kanäle, was ich in dieser Arbeit durch den spezifischen Kanal-Inhibitor Isradipin bestätigen konnte, nicht maßgeblich an dem Ca2+-Signal beteiligt. Die tatächliche Reaktionskaskade führt über den Angiotensin-AT1-Rezeptor, wahrscheinlich den second messenger IP3, zu einer Entleerung intrazellulärer Ca2+-Speicher. Die Entleerung der intrazellulären Speicher bewirkt über ein bisher unbekanntes Signal die Öffnung speicheraktivierter Ca2+-Kanäle in der Zellmembran und führt dadurch zu einem Ca2+-Einstrom von extrazellulär. Die Hemmstoffe speicheraktivierter Ca2+-Kanäle vom TRPC-Typ, Gadolinium und 2-APB, konnten diese Kanäle hemmen, so dass die Plateauphase verschwand. Das Zusammenspiel der beiden second messenger cAMP und [Ca2+]i wurde ebenfalls untersucht. Erhöhte cytoplasmatische cAMP-Konzentrationen führen in RSZ der Rattenniere überraschenderweise zu einer Erhöhung der [Ca2+]i. Diese geschieht aber nicht wie üblich über die Proteinkinase A, da die spezifischen PKA-Hemmstoffe H-89 und KT5720 keinen Einfluss auf die Reaktion der Zellen hatten. Die Reninsekretion wird durch unterschiedliche extrazelluläre Osmolaritäten reguliert. Die Signaltransduktionswege dieser Regulation sind bisher nicht bekannt und wurden in meiner Arbeit untersucht. In meinen Messungen konnte ich eine Erhöhung der [Ca2+]i durch hypoosmolare extrazelluläre Bedingungen auslösen. Die hierfür verantwortlichen Kanäle konnten jedoch nicht identifiziert werden.Today hypertonia is an important medical problem. Ethiological the renin angiotensin aldosterone system (RAAS) is a central mechanism in the formation of the high blood pressure. Renin becomes mainly secreted into the bloodstream by the juxtaglomerular cells of the kidney (RSZ). This represents the activity-decisive step in the RAAS. The regulating mechanisms of the renin release are only incompletely cleared up but could be a starting point for new medications in the therapy of hypertonia. Most important first messenger in this system is angiotensin II (ANG II) which decrease the renin release over a negative feedback. Important second messenger is the cytoplasmatic cAMP concentration and the free cytoplasmatic Ca2+ concentration ([Ca2+]i). Endocellular Ca2+ causes an inhibition, endocellular cAMP an increase of the renin secretion. The renin secretion is additionally influenced by the extracellular osmolarity. In the present work [Ca2+]i in RSZ of the rat kidney was examined by quantitative fluorescence microscopy. ANG II causes an increase of [Ca2+]i in these cells. This signal can be divided in two different phases, a steep increase with subsequent waste (Peak) and a phase with steadily increased [Ca2+]i data (Plateau). Up to now it is not completely clarified which Ca2+ channels and compartments are responsibly for the different phases of this Ca2+ signals, so this was the central point of my work. RSZ gets depolarized by ANG II. The existing voltage-activated Ca2+ channel doesn't involve decisively the Ca2+ signal. This is what I could demonstrate in this work with isradipine, a specific voltage-activated Ca2+ channel inhibitor. The real reaction cascade leads to an emptying of endocellular Ca2+ stores by the angiotensin-AT1-receptor, probably by the second messenger IP3. The emptying of the endocellular storages causes the opening of storage-activated Ca2+ channels over an unknown signal and leads to a Ca2+ influx of extracellular Ca2+. The inhibitors of store-activated Ca2+ channels (TRPC-Typ) such as gadolinium and 2-APB could close these channels so the plateau phase disappeared. The interplay between the two second messenger cAMP and [Ca2+]i was also examined. Increased cytoplasmatic cAMP concentration leads to an increase of the [Ca2+]i surprisingly. This doesn't happen by the protein kinase A like usual, because the specific PKA inhibitors H-89 and KT5720 didn't have any influence on the reaction of the cells. The renin secretion is also regulated by different extracellular osmolarities. The signal transduction ways of this regulation are not known until now and were examined in my work. In my measurements hypoosmolar extracellular conditions caused an increase in [Ca2+]i. The channels for this responsible were not identified