Evaluation of marker genes for the detection of disseminated tumor cells in bone marrow aspirates of female patients with breast cancer with nested- RT- PCR

Wie bei anderen Malignomen wird auch beim Mammakarzinom seit Jahren nach Markergenen gesucht, die über ihren Nachweis von disseminierten Tumorzellen eine systemische Ausbreitung der Grunderkrankung anzeigen mit daraus resultierendem erhöhtem Risiko für das Auftreten von Fernmetastasen und Rezidiven. Ziel ist es, Patientinnen zu identifizieren, die einer aggressiveren adjuvanten Therapie bedürfen, beziehungsweise diese nicht benötigen. Als potentielle Markergene werden unter anderem Maspin, Mammaglobin, Zytokeratin 20 (CK20) und das Carcinoembryonale Antigen (CEA) in der Literatur diskutiert. Dabei tauchten immer wieder Literaturberichte auf, die über falsch- positive Ergebnisse bei gesunden Kontrollpersonen berichteten. So ist für das Mammakarzinom bis heute kein spezifisches Markergen bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Tauglichkeit der einzelnen oben genannten Markergene zum Nachweis disseminierter Tumorzellen in Knochenmarksaspiraten von 80 Patientinnen mit Mammakarzinomen unterschiedlicher Stadien mittels nested- RT- PCR untersucht werden. Die PCR Primer und Reaktionsbedingungen wurde durch Untersuchung nativen Mammakarzinomgewebes sowie zwei verschiedener Mammakarzinom- Zelllinien etabliert. Als Negativkontrollen standen tumorfreie Lymphknoten von Patienten mit malignen Melanomen zur Verfügung. Die strukturelle Intaktheit der extrahierten gesamtRNA wurde durch Amplifikation der beiden sogenannten housekeeping Gene beta-2-Mikroglobulin (beta-2-MG) und Porphobilinogen Deaminase (PBGD) überprüft. Spezifische Transkripte aller vier ausgewählten Markergene waren jeweils in den Mammakarzinomgeweben und den Zelllinien nachweisbar, nicht dagegen in den Kontroll-Lymphknoten. Im gesamten Patientinnenkollektiv wurden Transkripte von Maspin in 24 Fällen (30%), Transkripte von Mammaglobin in zwei Fällen (2,5%), Transkripte von CK20 in 35 Fällen (44%) und Transkripte von CEA in 71 Fällen (89%) nachgewiesen. Es war dabei keine eindeutige Korrelation zu bestimmten Tumorstadien erkennbar. Von sechs Patientinnen mit bereits manifesten Fernmetastasen wies eine Patientin ein Transkript von Maspin auf, und zwei Patientinnen wiesen Transkripte von Mammaglobin auf. Bei einer Patientin konnte ein Transkript von CK20 nachgewiesen werden, und bei vier Patientinnen Transkripte von CEA. Diese Ergebnisse unterschieden sich nicht signifikant von der Prävalenz dieser Transkripte im Gesamtkollektiv. Ob sich für die gefundenen Ergebnisse nach einer längeren Nachbeobachtungsphase eindeutigere Korrelationen zwischen Markergennachweis und metastasiertem/ rezidiviertem Mammakarzinom ergeben hätten, bleibt ungeklärt, da sich eine solche Nachbeobachtung über viele Jahre ohne adjuvante Therapie schon aus ethischen Gründen verbietet. Zusammenfassend kann auch nach den Ergebnissen dieser Studie keine besondere Empfehlung zu einem der untersuchten Markergene gemacht werden, und der Einsatz molekularbiologischer Methoden zum Nachweis einer Tumorzelldissemination mit daraus möglicherweise resultierenden therapeutischen Konsequenzen ist zu diesem Zeitpunkt äußerst kritisch zu bewerten.Similar to other malignomas, years have been spent searching for the marker genes of breast cancer which, if isolated, would enable the detection of disseminated tumour cells. The disseminated tumour cells indicate a systematic spreading of the main disease, which signifies an increased risk of metastases and relapse. The aim is to identify patients who need an aggressive adjuvant therapy from those who do not. Maspin, Mammaglobin, Cytoceratin (CK20) and Carcinoembryonic Antigen (CEA) have been discussed as potential marker genes in literature. Time and time again though, these reports have proved to be false positive results in healthy control persons. To date no specific marker gene for breast cancer is known. In this study we examined the suitability of the above mentioned marker genes for the detection of disseminated tumour cells in bone marrow aspirates of 80 female patients with breast cancer in different stages, with nested-RT-PCR PCR primers and reaction conditions were determined by the examination of native breast caner tissues and two different breast cancer cell lines. Tumour free lymph nodes of patients with melanoma were used as the negative controls. The intact structure of the extracted RNA was then confirmed by the amplification of the two house-keeping genes, beta-2 MG and PBGD. Specific transcripts of all four markers were detected in the breast cancer tissue and all the cell lines, but not in the lymph node negative controls. Of the patients tested, transcripts of Maspin were detected in 24 cases (30%), Mammaglobin in 2 cases (2.5%), CK20 in 35 cases (44%) and CEA in 35 cases (89%). There was no correlation between the transcripts found and the determined tumour stages. Of six patients with manifest metastases, one showed a transcript of Maspin, and two showed transcripts of Mammaglobin, one showed a transcript of CK20 and transcripts of CEA were detected in four of them. The differences in the results for the patients with manifest metastases to the collective group were not significant. It is not clear if these results would show a clearer correlation between the detection of marker genes, and metastases/relapses for breast cancer after a longer period of observation. It is important to add that longer periods of observation without adjuvant therapy are not allowed due to ethical reasons. In conclusion, it can be said that no specific recommendation for any of the four examined marker genes can be given. Therefore the use of molecular biological methods for the detection of tumour cell dissemination has to be viewed in a very critical manner to date