Human Monocytes Phagocytosis of apoptotic human Lymphocytes - Influence by the Plasma Expanders

Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren Untersuchungen zum Einfluss der künstlichen Kolloide (KK) Dextran (DEX), Gelatine (GEL) und Hydroxyethylstärke (HES) auf die Phagozytose apoptotischer humaner Lymphozyten (Lo) durch humane Monozyten (Mo) in vitro. Hierzu wurden aus dem Buffy Coat freiwilliger Spender zunächst Mo und Lo isoliert, diese daran anschließend unter standardisierten sterilen Bedingungen separiert. Mit Hilfe unterschiedlicher Methoden wurde die Viabilität und Zellzahl bestimmt. Nach Induktion von Apoptose mittels Glukokortikoid (Dexamethason) und Staurosporin, wurden die Lo über 12 Stunden in Kokultur mit Mo, im Standardmedium zur Kontrolle, als auch unter dem Einfluss der KK in Konzentrationen von 5mg/ml oder 20mg/ml gehalten. Mittels verschiedener Färbetechniken zur Markierung typischer Apoptosemerkmale, wurde der Einfluss der KK auf das Phagozytoseverhalten bestimmt. Neben licht- und fluoreszenzmikroskopischen Analysen kamen im wesentlichen durchflusszytometrische Methoden zur Anwendung. Als Einfluss der untersuchten KK auf die Phagozytose von Lo durch Mo nach induzierter Apoptose in vitro, konnte bei steigender Konzentration der KK in allen Fällen eine Reduktion der Phagozytose gezeigt werden. Signifikant war die Reduktion durch HES sowohl bei einer Konzentration von 5mg/ml als auch bei 20mg/ml, bei DEX und GEL jeweils nur bei einer Konzentration von 20mg/ml. Als Ursachen dieser Reduktion werden spezifische Rezeptor-Theorien diskutiert. Eine Möglichkeit ist eine Änderung der CD14-Oberflächenantigen-Expression der Mo, verursacht durch die KK und damit eine Änderung des für die Phagozytose notwendigen Rezeptors. Eine Andere ist im Sinne einer Konkurrenz am Rezeptor zu verstehen. Möglicherweise binden sowohl KK, als auch apoptotische Zellen an den gleichen Rezeptoren. Zudem ist ein mögliches Sättigungsverhalten der Mo denkbar, da KK von Mo aufgenommen und gespeichert werden, welches zur Reduktion der Phagozytose führt.This study examined whether human monocytes (Mo) phagocytosis of apoptotic human lymphocytes (Lo) is influenced by the plasma expanders (PE) dextran (DEX), gelatin (GEL) and hydroethylstarch (HES) in vitro. Mo and Lo were isolated from buffy coats of voluntary donors and afterwards separated under standardized sterile conditions. With the aid of different methods the viability and the number of cells were determined. Apoptosis was induced by glucocorticoid (dexamethasone) and staurosporine. Lo and Mo were cultured together in standard medium and with the PE in concentrations of 5mg/ml or 20mg/ml for 12h. By using different staining methods to mark typical apoptotic characteristics, the impact of PE on phagocytosis was determined. Apart from light microscopic and fluorescence microscopic analysis flow cytometric assays were used in the manner. As an influence the examined PE had on Mo phagocytosis of Lo which were apoptosis induced in vitro, in all cases with increasing concentrations of PE a reduction of phagocytosis has been shown. The reduction of HES was significantly in the concentration of 5mg/ml as well as of 20mg/ml, for DEX and GEL only in the concentration of 20mg/ml. As reasons for this reduction specific receptor theories are being discussed. Caused by PE one possibility is an alteration of CD14 expression on Mo caused and thereby an alteration of the receptor for phagocytosis. Another purpose is a competition on the specific receptor. It is possible that PE as well as apoptotic cells bind on the same receptor. Moreover a possible saturation manner of Mo is conceivable, because PE are ingested and stored by Mo which results in a reduction of phagocytosis. To what extend these results can though be confirmed in vivo and whether this causes variations in therapy with PE is subject to ongoing studies