Posttranskriptionale Regulation von Myelin-mRNAs

Die Myelinisierung neuronaler Axone ermöglicht eine schnelle und energieeffiziente Weiterleitung von Informationen im Nervensystem. Durch lokale Synthese von Myelinproteinen kann die Myelinschicht, zeitlich und räumlich reguliert, gebildet werden. Dieser Prozess ist abhängig von verschiedensten axonalen Eigenschaften und muss damit lokal reguliert werden. Die Myelinisierung im zentralen sowie im peripheren Nervensystem hängt unter anderem stark von kleinen regulatorischen RNA Molekülen ab. In Oligodendrozyten wird das Myelin Basische Protein (MBP) von der sncRNA715 translational reguliert, indem diese direkt innerhalb der 3’UTR der Mbp mRNA bindet und damit die Proteinsynthese verhindert. Mbp mRNA wird in hnRNP A2‐enthaltenen RNA Granula in die Zellperipherie transportiert, wo in Antwort auf axonale Signale die membranständige Tyrosin‐ Kinase Fyn aktiviert wird, welche Granula‐Komponenten wie hnRNP A2 und F phosphoryliert wodurch die lokale Translation initiiert wird. Während des Transports wird die mRNA durch die Bindung der sncRNA715 translational reprimiert. SncRNAs bilden zusammen mit Argonaut‐Proteinen den microRNA induced silencing complex (miRISC), welcher die translationale Inhibition oder den Abbau von mRNAs vermittelt. In der vorliegenden Arbeit sollte zum einen die Regulation der sncRNA715‐abhängigen translationalen Repression der Mbp mRNA in oligodendroglialen Zellen genauer untersucht werden und im zweiten Teil wurde die Rolle der sncRNA715 in den myelinbildenden Zellen des peripheren Nervensystems, den Schwann Zellen, analysiert. Es konnte in oligodendroglialen Zellen die mRNA‐Expression der vier, in Säugern bekannten Argonaut‐Proteinen nachgewiesen werden. Außerdem konnten die beiden Proteine Ago1 und Ago2 in vitro sowie in vivo detektiert werden. Ago2 interagiert mit hnRNP A2, Mbp mRNA und sncRNA715, womit es als neue Komponente des Mbp mRNA Transportgranulas identifiziert werden konnte. Des Weiteren colokalisiert Ago2 mit der Fyn‐Kinase und alle vier Argonaut‐Proteine werden Fyn‐abhängig Tyrosin‐phosphoryliert. Die Fyn‐abhängige Phosphorylierung der Granula‐Komponenten in Antwort auf axo‐glialen Kontakt führt zum Zerfall des RNA‐Granulas und zur gesteigerten MBP Proteinsynthese. Dies wird möglicherweise durch Abstoßungskräfte der negativ geladenen phosphorylierten Proteine vermittelt, wodurch diese sich voneinander und von der mRNA entfernen. Durch die Ablösung des miRISCs von der Mbp mRNA wird die Translation möglicherweise reaktiviert und die Myelinisierung kann starten. Mit der Identifizierung von Ago2 als neuer Mbp mRNA Transportgranula‐Komponente konnte ein weiterer Einblick in die Regulation der lokalen Translation von MBP gewährt werden. Das Verständnis dieses Prozesses ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien von demyelinisierenden Erkrankungen, da neue Faktoren als eventuelle Ziele für pharmakologische Manipulationen identifiziert und möglichweise neue Therapiemöglichkeiten entstehen könnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die translationale Regulation von Mbp mRNA in Schwann Zellen untersucht. Auch Schwann Zell‐Mbp wird als mRNA translational inaktiviert zur axo‐glialen Kontaktstelle transportiert, wo vermutlich auch lokale Translation in Antwort auf spezifische Signale stattfindet. Allerdings bleiben die genauen Mechanismen der mRNA‐Lokalisation und damit verbundenen translationalen Repression bislang ungeklärt. Es konnte hier gezeigt werden, dass auch in Schwann Zellen die sncRNA715 exprimiert wird und die Translation von Mbp reguliert. Überexpression der synthetischen sncRNA715 führt zu einer signifikanten Reduktion der MBP Proteinmengen in differenzierten primären Schwann Zellen. Damit kann vermutet werden, dass die Regulation der lokalen MBP Proteinsynthese in Schwann Zellen der in Oligodendrozyten ähneltThe myelination of neuronal axons facilitates fast and energy efficient transmission of information in the nervous system. Myelin sheath growth requires local synthesis of myelin proteins which is spatially and temporally regulated. This process must be regulated locally to respond to diverse axonal properties. Myelination in the peripheral as well as in the central nervous system is controlled by small regulatory RNAs. In oligodendrocytes translation of Myelin Basic Protein is dependent on sncRNA715, which binds directly in the 3’UTR of Mbp mRNA and inhibits its translation. Mbp mRNA is transported into the cell periphery in hnRNP A2‐containing RNA granules. At the axo‐glial contact site the tyrosine kinase Fyn is activated in response to axonal signaling and phosphorylates granule components like hnRNP A2 and F which leads to granule dissociation and translation initiation. During transport binding of sncRNA715 inhibits premature translation of Mbp mRNA. SncRNAs together with Argonaute proteins form the microRNA induced silencing complex (miRISC), which is responsible for translational repression or mRNA decay. It was the aim of the project described here to analyze the regulation of sncRNA715‐dependent translational inhibition of Mbp mRNA in oligodendroglial cells. In the second part, the role of sncRNA715 in the myelinating cells of the peripheral nervous system, the Schwann cells, was investigated. In oligodendroglial cells mRNA expression of the four mammalian Argonaute proteins could be shown. Furthermore the proteins Ago1 and Ago2 could be detected in vitro and in vivo. Ago2 interacts with hnRNP A2, Mbp mRNA and sncRNA715 and with this is identified as a new component of Mbp mRNA transport granules. In addition Ago2 colocalizes with Fyn kinase and all four Agos are shown to be tyrosine phosphorylated by Fyn. Fyn‐dependent phosphorylation of granule components in response to axon‐glial signaling presumably leads to granule breakdown and increases MBP protein synthesis. This could be mediated by repulsive forces of the negatively charged phosphorylated proteins by which proteins detach from another resulting in the removal of the miRISC from the mRNA and translational reactivation of repressed mRNA. With the identification of Ago2 as a new component of Mbp mRNA transport granules we have provided new insights into the regulation of local MBP translation in oligodendrocytes. The understanding of this process is important for new therapy developments for demyelinating diseases, because new factors were identified as targets for potential pharmacological manipulations. In the second part of this work the translational regulation of Mbp mRNA in Schwann cells was analyzed. Similar to oligodendroglial Mbp, Schwann cell‐Mbp is transported as translationally repressed mRNA to the axon‐glial contact site, where local translation in response to specific axonal signals takes place. The distinct mechanisms of mRNA localization and translational repression in Schwann cells have not been unraveled so far. It was shown here that also Schwann cells express sncRNA715 and that this small RNA controls Mbp translation. Overexpression of a synthetic sncRNA715 sequence in primary Schwann cells leads to significantly decreased MBP protein levels. This suggests a similar regulatory mechanism for local Mbp translation in Schwann cells as in oligodendrocyte