Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien

Analysen zur molekularen Charakterisierung von Proteinen des humanen Usher-Syndroms und Evaluation genbasierter Therapiestrategien rnDas humane Usher Syndrom (USH) ist die häufigste Form vererbter Taub-Blindheit. In der vorliegenden Dissertation wurde diese komplexe Erkrankung auf verschiedenen Ebenen analysiert: in Arbeiten zur Expression und Lokalisation von USH-Proteinen, der Analyse der USH-Proteinnetzwerke und deren Funktionen sowie darauf aufbauend die Entwicklung von Therapiestrategien für USH.rnIm Rahmen der Arbeit wurde die Expression und (sub)-zelluläre Lokalisation des USH1D-Genproduktes CDH23 in der Retina und Cochlea analysiert. CDH23-Isoformen werden in der Maus zeitlich und räumlich differentiell exprimiert. In den Retinae von Mäusen, nicht humanen Primaten und Menschen zeigten Analysen eine unterschiedliche Expression und Lokalisation des Zell-Zelladhäsionsmoleküls CDH23, was auf Funktions-unterschiede der einzelnen Isoformen in den analysierten Spezies hindeutet.rnAnalysen zur Aufklärung der USH-Proteinnetzwerke ergaben eine potentielle Interaktion des USH1G-Gerüstproteins SANS mit dem Golgi- und Centrosom-assoziierten Protein Myomegalin. Die direkte Interaktion der Proteine konnte durch unabhängige Experimente verifiziert werden. Beide Interaktionspartner sind in den Retinae verschiedener Spezies partiell ko-lokalisiert und partizipieren im periciliären USH-Proteinnetzwerk. Die Assoziation von SANS und Myomegalin mit dem Mikrotubuli-Cytoskelett weist auf eine Funktion des Proteinkomplexes in gerichteten Transportprozessen innerhalb der Photorezeptoren hin und bekräftigt die Hypothese einer Rolle von SANS und assoziierten Netzwerken mit Transportprozessen.rnDas hier gewonnene erweiterte Verständnis der molekularen Grundlagen sowie die Aufklärung der zellulären Funktion der Proteinnetzwerke ermöglichen die Entwicklung therapeutischer Strategien für USH. Ein Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf der Entwicklung genbasierter Therapiestrategien und deren Evaluation, wobei der Schwerpunkt auf der Therapiestrategie der Genreparatur lag. Die mit Hilfe von Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) induzierte Homologe Rekombination für die Genkorrektur wurde exemplarisch an der 91C>T/p.R31X-Mutation im USH1C-Gen gezeigt. Effiziente ZFN wurden identifiziert, generiert und erfolgreich im Zellkulturmodellsystem eingesetzt. Die Analysen demonstrierten eine Reparatur der Mutation durch Homologe Rekombination auf genomischer Ebene und die Expression des wiederhergestellten Proteins. Durch die Genkorrektur im endogenen Lokus sind Größe des Gens, Isoformen oder die Art der Mutation keine limitierenden Faktoren für die Therapie. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente unterstreichen das enorme Potential ZFN-basierter Therapiestrategien hin zu personalisierten Therapieformen nicht nur für USH sondern auch für andere erbliche Erkrankungen, deren genetische Grundlagen bekannt sind.rnSummary PhD thesisrnThe human Usher syndrome is the most common form of combined hereditary deaf-blindness. This complex disease was analyzed on different levels: by the analysis of expression and localization of USH proteins, the analysis of USH protein networks and their function and based on this the elaboration of therapeutic strategies for the treatment of USH.rnThe expression and (sub) cellular localization of the USH1D gene product cadherin23 was analyzed in the retina and cochlea. In the mouse CDH23 isoform expression is temporally and spatially regulated. In the retina of mice, non-human primates and humans CDH23 is expressed and localized differentially, indicating different functions of the cell-cell adhesion molecule in the analyzed species. rnAnalyses for the decipherment of the USH protein network revealed a potential interaction of the USH1G protein SANS with the Golgi and centrosome associated protein myomegalin. The direct interaction of the proteins was validated by independent methods. Both proteins are partially co-localized in the retina of different species and participate in the periciliary USH protein network. The association of SANS and myomegalin with the microtubule cytoskeleton indicates a function of the complex in photoreceptor cell transport and strengthens the hypothesis for a role of SANS and associated networks in transport processes. rnThe gathered knowledge of the molecular basis and the decipherment of the cellular function of USH proteins enable the establishment of therapeutic strategies for USH. One focus of the present work was the development of gene-based therapies and their evaluation, with the emphasis on a strategy for gene repair by homologous recombination. This represents a powerful method to correct genetic defects. The strategy of zinc finger nuclease (ZFN) induced homologous recombination was used to exemplarily correct the 91C>T/p.R31X nonsense mutation in the USH1C gene. Screening the mutated USH1C sequence for plausible zinc finger binding sites revealed six promising pairs of ZFNs. Potential ZFNs were identified, generated by modular assembly, and the nuclear localization was verified upon transfection in HEK293T cells. Efficient ZFN were successfully tested in a 91C>T/p.R31X cell culture model system. PCR demonstrated cleavage of the target sequence in vitro by ZFN. Successful gene repair mediated by ZFN induced homologous recombination and an exogenously introduced rescue plasmid encoding for the healthy USH1C gene was shown on genomic level by TseI digestion and sequencing. Expression of the repaired USH1C gene product harmonin demonstrated ZFN activated gene repair on protein level, analyzed by indirect immunofluorescence and Western blot. rnDue to the repair of the gene in its endogenous locus the size of the gene, isoforms and the type of mutation are no limiting factors for therapy. The performed experiments underline the enormous potential of ZFN based strategies in the direction of personalized therapies not only for USH but also other inherited diseases