Cytotoxicity and P-glycoprotein inhibition by cardiotonic steroids

Herzwirksame Glykoside sind in der Natur sowohl im Tier- als auch im Pflanzenreich zu finden und werden regelmäßig zur Therpaie von Herzinsuffizienz eingesetzt. In letzter Zeit belegten viele Studien, dass herzwirksame Glykoside vielversprechende Substanzen für die Behandlung von Krebs darstellen. Ihr Wirkmechanismus basiert auf der Hemmung der Na+/K+-ATPase. Die Na+/K+-ATPase spielt neuerdings eine wichtige Rolle in der Krebsbiologie, da sie viele relevante Signalwege beeinflusst. Multiresistenzen gegen Arzneimittel sind oftmals verantwortlich für das Scheitern einer Chemotherapie. Bei multi-drug-resistenten Tumoren erfolgt ein Transport der Chemotherapeutika aus der Krebszelle hinaus durch das Membranprotein P-Glykoprotein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Zytotoxizität von 66 herzwirksamen Glykosiden und ihren Derivaten in sensitiven und resistenten Leukämie-Zellen getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Naturstoffe die Zell-Linien in verschiedenen molaren Bereichen abtöten. Allerdings waren die Resistenz-Indizes niedrig (d. h. die IC50 Werte waren in beiden Zell-Linien ähnlich). Die untersuchten 66 Substanzen besitzen eine große Vielfalt an chemischen Substituenten. Die Wirkung dieser Substituenten auf die Zytotoxizität wurde daher durch Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) erforscht. Des Weiteren wiesen quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehung (QSAR) und molekulares Docking darauf hin, dass die Na+/K+-ATPase in sensitiven und resistenten Zellen unterschiedlich stark exprimiert wird. Eine Herunterregulation der Na+/K+-ATPase in multi-drug-resistenten Zellen wurde durch Western Blot bestätigt und die Wirkung dieser auf relevante Signalwege durch Next-Generation-Sequenzierung weiter verfolgt. Dadurch konnte eine Verbindung zwischen der Überexpression von P-Glykoprotein und der Herunterregulation der Na+/K+-ATPase hergestellt werden. Der zweite Aspekt der Arbeit war die Hemmung von P-Glykoprotein durch herzwirksame Glykoside, welche durch Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie getestet wurde. Sechs wirksame Glykoside konnten den P-Glykoprotein-vermittelten Transport von Doxorubicin inhibieren. Zudem konnte die Zytotoxität von Doxorubicin in multi-drug-resistenten Zellen teilweise wieder zurück erlangt werden. Unabhängig von herzwirksamen Glykosiden war die Bewertung der Anwendung von molekularem Docking in der P-Glykoprotein Forschung ein weiterer Aspekt der Arbeit. Es ließ sich schlussfolgern, dass molekulares Docking fähig ist, zwischen den verschiedenen Molekülen zu unterscheiden, die mit P-Glykoprotein interagieren. Die Anwendbarkeit von molekularem Docking in Bezug auf die Bestimmung der Bindestelle einer Substanz wurde ebenfalls untersucht.Cardiotonic steroids, which are regularly used in the treatment of heart failure, are natural compounds encountered throughout the plant and animal kingdom and are considered to be promising chemotherapeutics. Na+/K+-ATPase has been established as the molecular target of cardiotonic steroids. Recently, Na+/K+-ATPase has been implicated in cancer biology affecting several signaling pathways. Classical multidrug resistance – mediated by P-glycoprotein – is responsible for chemotherapy failure in certain tumors by extruding many chemotherapeutics outside the cell. In this study, we evaluated cytotoxicity of 66 cardiotonic steroids and their derivatives in two sensitive and multidrug-resistant leukemia cell lines. Results revealed cytotoxicity of many of the compounds at various molar ranges but all with low resistance indices (i.e. similar IC50 values between sensitive and resistant cell lines). Data were subject to structure-activity relationship (SAR), qunatitative structure-activity relationship (QSAR), and molecular docking on Na+/K+-ATPase, which first elaborated the role of chemical substitutions on cytotoxicity and second pointed out a possible differential expression of Na+/K+-ATPase of the two cell lines. By immunoblotting, a down-regulation of Na+/K+-ATPase in multidrug-resistant cells was confirmed, which was tracked down by next generation sequencing further unraveling deregulations of Na+/K+-ATPase signalosome in multidrug-resistant cells. Thereby, a link between Na+/K+-ATPase down-regulation and P-glycoprotein expression was established. We further tried to discover any inhibitors of P-glycoprotein by means of high throughput flow cytometry. Six cardiotonic steroids were able to inhibit P-glycoprotein-mediated efflux and partially restore the cytotoxic effect of doxorubicin – a substrate of P-glycoprotein – in multidrug-resistant cells. Separately, we evaluated the application of molecular docking in P-glycoprotein research by assessing its ability to first discriminate between different P-glycoprotein-interacting groups of molecules, and second to predict the binding site of a certain molecule. After thorough statistical analysis, we conclude, despite the various challenges, that molecular docking should not be underestimated as differences between the distinct groups were significant. Furthermore, the ability of molecular docking to define the binding site of a substance was explored