Induktion tolerogener dendritischer Zellen zur Suppression von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis und Kontaktallergie

Dendritische Zellen (DC) spielen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC) eine zentrale Rolle in der Aktivierung und Regulierung antigenspezifischer Immunantworten. Aus diesem Grund wird der therapeutische Einsatz von DC zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien sowie zur Tumorbekämpfung erforscht. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit untersuchten wir das Potenzial einer biolistischen DNA-Vakzinierung zur Induktion tolerogener DC in vivo. Im Tiermodell der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein Peptid 35-55 (MOGp35-55) induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) sollte mittels präventiver biolistischer Kovakzinierung von Plasmid-DNA kodierend für MOG und die immunregulatorischen Zytokine TGFβ oder IL-10 eine protektive Immunität induziert werden. Die MOG-Expression stand dabei entweder unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV-Promotors oder des murinen Fascin-Promotors, um eine ektopische MOG-Expression spezifisch in dermalen DC und Langerhanszellen zu erreichen. Dass MOGp35-55-präsentierende DC nach biolistischer DNA-Vakzinierung von der Haut in die drainierenden Lymphknoten migrieren und dort T-Zellen aktivieren, konnte im Vorfeld anhand einer substanziellen Proliferation von MOGp35-55-reaktiven 2D2 T-Zellen nachgewiesen werden. Im präventiven Ansatz der MOGp35-55-induzierten EAE zeigten Mäuse, die mit MOG-kodierenden Plasmiden biolistisch transfiziert wurden, eine leicht reduzierte EAE-Symptomatik. Die Kotransfektion von MOG und TGFβ führte zu einer Verstärkung der EAE-Suppression – unabhängig davon, ob die MOG-Expression unter der Kontrolle des CMV- oder des Fascin-Promotors stand. Interessanterweise resultierte die Koapplikation von MOG- und IL-10-kodierender Plasmid-DNA nur bei DC-fokussierter MOG-Expression zu reduzierter EAE-Symptomatik. Für biolistische DNA-Vakzinierungen stellt somit der Fascin-Promotor eine potente Alternative zu viralen Promotoren dar. Entsprechend der milderen EAE-Symptome beobachteten wir bei behandelten EAE-Mäusen einen geringeren Grad an Demyelinisierung sowie eine reduzierte Infiltration des ZNS mit IFNγ-produzierenden CD4+ Th1- und IL-17-produzierenden CD4+ Th17-Zellen. Desweiteren zeigten Milzzellen ex vivo nach MOGp35-55-Restimulation eine inhibierte Proliferation und eine signifikant reduzierte IFNγ- und IL-17-Zytokinproduktion. Überraschenderweise ging die antigenspezifische Immunsuppression nicht mit der Expansion von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen einher. Da die Milzen aber erhöhte Mengen an CD8+IFNγ+ T-Zellen aufweisen, könnte ein zytotoxisch-suppressiver Mechanismus für die Inhibition der Th1- und Th17-Immunantwort verantwortlich sein. Nachfolgende Untersuchungen sind notwendig, um die induzierten immunologischen Mechansimen mittels biolistischer DNA-Vakzinierung aufzuklären. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Generierung von tolerogenen DC in vitro. Dafür wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen in Gegenwart des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason (DEX) kultiviert. Die DEX-Zugabe führte zur Differenzierung von APC mit geringer CD11c-Expression. DEX-APC waren in vitro weitestgehend gegen LPS stimulierungsresistent und zeigten eine reduzierte Expression von MHC-II und den kostimulatorischen Molekülen CD80, CD86 und CD40. Ihrem tolerogenen Phänotyp entsprechend besaßen DEX-APC ein geringeres syngenes T-Zellstimulierungspotenzial als unbehandelte BM-DC. Anhand der erhöhten Oberflächenexpression von CD11b, GR1 und F4/80 besteht eine phänotypische Ähnlichkeit zu myeloiden Suppressorzellen. Die Fähigkeit von DEX-APC in vivo antigenspezifische Toleranz zu induzieren, wurde durch einen therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie überprüft. Die therapeutische Applikation von DEX-APC führte hierbei im Vergleich zur Applikation von PBS oder unbehandelten BM-DC zu einer signifikant reduzierten Ohrschwellungsreaktion. Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Arbeit, dass potente tolerogene DC sowohl in vivo als auch in vitro induziert werden können. Dass diese Zellpopulation effektiv antigenspezifische Immunreaktionen supprimieren kann, macht sie zu einem vielversprechenden Werkzeug in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen und Allergien.rnDendritic cells (DC) are professional antigen-presenting cells (APC) that play a pivotal role in activation and regulation of antigen-specific immune responses. Therefore it is a central scientific interest to use DC as a therapy of autoimmune disorders, allergies and tumours. In the first part of this thesis we investigated the potential of biolistic gene transfer via the skin to induce tolerogenic DC in vivo. In an animal model of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOGp35-55)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) we performed preventive biolistic coadministration of plasmid DNA encoding MOG and the immunoregulatory cytokines TGFβ and IL-10 to induce protective immunity. MOG expression was either under control of the murine DC specific fascin promoter to transcriptionally target ectopic MOG expression to dermal DC and Langerhans cells or under control of the ubiquitously active CMV promoter. Initially the in vivo activation of MOG-reactive T cells via biolistic DNA vaccination was investigated. Flow cytometry analyses revealed a substantial proliferation of MOGp35-55-reactive 2D2 T cells indicating migration of MOGp35-55-presenting DC from the skin to the draining lymph nodes. In a preventive experimental setting of MOGp35-55-induced EAE, mice transfected with MOG-encoding plasmids alone displayed a slight amelioration of EAE symptoms. This suppressive effect was enhanced by co-expression of TGFβ and independent from the promoter controlling MOG-expression making the fascin promoter a powerful alternative to viral promoters for DNA vaccination. Interestingly the co-application of MOG- and IL-10-encoding plasmid DNA ameliorated EAE symptoms only when ectopic MOG expression was targeted specifically to DC. Accordant to reduced EAE symptoms we observed a reduced demyelinisation and a decreased infiltration of IFNγ producing CD4+ Th1 cells and IL-17 producing CD4+ Th17 cells in the central nervous system (CNS). Furthermore, upon antigen-specific in vitro restimulation splenocytes of treated EAE-mice showed inhibited proliferation and significantly reduced IFNγ and IL-17 cytokine production. Suprisingly, antigen-specific immune suppression is not due to an expansion of Foxp3+ regulatory T cells. It could possibly derive from a cytotoxic-suppressive mechanism, since the spleens of DNA vaccinated EAE-mice display significantly enhanced numbers of CD8+IFNγ+ T cells. To closely characterize the mechanisms responsible for the suppressed immune reaction further analyses of the immunological effects triggered by biolistic DNA-vaccination are necessary. The second part of this thesis focusses on the generation of tolerogenic DC in vitro. Murine bone marrow cells were cultured under conditions prompting a differentiation of bone marrow-derived DC (BM-DC) and the synthetic glucocorticoid (GC) dexamethasone (DEX) was added. GC are known to be produced endogenously in response to inflammation as a negative feedback regulatory mechanism by cells of the adrenal cortex. Here we show that early addition of DEX to BM-DC culture results in the differentiation of CD11clow APC characterized by reduced expression of MHC-II and the costimulatory molecules CD80, CD86 and CD40 compared to BM-DC. Furthermore these so called DEX-APC displayed resistance to upregulate these molecules upon stimulation with LPS. In contrast to untreated BM-DC and accordant to their tolerogenic phenotype DEX-APC fail to potentially stimulate syngenic T-cells in vitro at either state of stimulation. Further flow cytometry analyses revealed that DEX-APC highly express CD11b, GR1 and F4/80, resembling the phenotypic characteristics of myeloid derived suppressor cells. To analyse if in vitro differentiated DEX-APC can induce antigen-specific tolerance in vivo we used the animal model of contact hypersensitivity (CHS). The therapeutic application of DEX-APC resulted in a significantly reduced ear swelling reaction compared to untreated BM-DC or PBS control. In summary, the results of this thesis demonstrate that the induction of potent tolerogenic DC is possible in vivo and in vitro and that this cell population can vitally drive suppressive antigen-specific immune reactions which are highly desired for the curation of autoimmunity and allergies.r