Etablierung eines high content imaging-basierten in vitro Testsystems zur Evaluierung genotoxischer Substanzen

Zur Registrierung von Pharmazeutika ist eine umfassende Analyse ihres genotoxischen Potentials von Nöten. Aufgrund der Vielzahl genotoxischer Mechanismen und deren resultierenden Schäden wird ein gestaffeltes Testdesign durch die ICH-Richtlinie S2(R1) „Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use S2(R1)“ definiert, um alle genotoxischen Substanzen zu identifizieren. Die Standardtestbatterie ist in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung aufgrund des geringen Durchsatzes und des Mangels an verfügbarer Substanzmenge vermindert anwendbar. Darüber hinaus verfügen in vitro Genotoxizitätstests in Säugerzellen über eine relativ geringe Spezifität. Für eine vollständige Sicherheitsbeurteilung wird eine in vivo Testung auf Kanzerogenität benötigt. Allerdings sind diese Testsysteme kosten- und zeitintensiv. Aufgrund dessen zielen neue Forschungsansätze auf die Verbesserung der Prädiktivität und die Erfassung des genotoxischen Potentials bereits in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung ab. Die high content imaging (HCI)-Technologie offeriert einen Ansatz zur Verbesserung des Durchsatzes verglichen mit der Standardtestbatterie. Zusätzlich hat ein Zell-basiertes Modell den Vorteil Daten relativ schnell bei gleichzeitig geringem Bedarf an Substanzmenge zu generieren. Demzufolge ermöglichen HCI-basierte Testsysteme eine Prüfung in der frühen Phase der pharmazeutischen Arzneimittelentwicklung. Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines neuen, spezifischen und sensitiven HCI-basierten Testsytems für Genotoxine und Progenotoxine in vitro unter Verwendung von HepG2-Zellen gewesen. Aufgrund ihrer begrenzten metabolischen Kapazität wurde ein kombiniertes System bestehend aus HepG2-Zellen und einem metabolischen Aktivierungssystem zur Testung progenotoxischer Substanzen etabliert. Basierend auf einer vorherigen Genomexpressionsprofilierung (Boehme et al., 2011) und einer Literaturrecherche wurden die folgenden neun unterschiedlichen Proteine der DNA-Schadensantwort als putative Marker der Substanz-induzierten Genotoxizität ausgewählt: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) p-ATM (Ser1981), p-ATR (Ser428), p-CDC2 (Thr14/Tyr15), GADD45A und p-Chk2 (Thr68). Die Expression bzw. Aktivierung dieser Proteine wurde 48 h nach Behandlung mit den (pro-) genotoxischen Substanzen (Cyclophosphamid, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen, Aflatoxin B1, 2-Acetylaminofluoren, Methylmethansulfonat, Actinomycin D, Etoposid) und den nicht-genotoxischen Substanzen (D-Mannitol, Phenforminhydrochlorid, Progesteron) unter Verwendung der HCI-Technologie ermittelt. Die beste Klassifizierung wurde bei Verwendung der folgenden fünf der ursprünglichen neun putativen Markerproteine erreicht: p-p53 (Ser15), p21, p-H2AX (Ser139), p-Chk1 (Ser345) und p-ATM (Ser1981). In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurden die fünf ausgewählten Proteine mit Substanzen, welche von dem European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) zur Beurteilung der Leistung neuer oder modifizierter in vitro Genotoxizitätstests empfohlen sind, getestet. Dieses neue Testsystem erzielte eine Sensitivität von 80 % und eine Spezifität von 86 %, was in einer Prädiktivität von 84 % resultierte. Der synergetische Effekt dieser fünf Proteine ermöglicht die Identifizierung von genotoxischen Substanzen, welche DNA-Schädigungen durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Mechanismen induzieren, mit einem hohen Erfolg. Zusammenfassend konnte ein hochprädiktives Prüfungssystem mit metabolischer Aktivierung für ein breites Spektrum potenziell genotoxischer Substanzen generiert werden, welches sich aufgrund des hohen Durchsatzes, des geringen Zeitaufwandes und der geringen Menge benötigter Substanz zur Substanzpriorisierung und -selektion in der Phase der Leitstrukturoptimierung eignet und darüber hinaus mechanistische Hinweise auf die genotoxische Wirkung der Testsubstanz liefert.Registration of pharmaceuticals requires a comprehensive assessment of their genotoxic potential. Due to the multitude of genotoxic mechanisms and resulting damages, a staggered testing design as defined by the ICH guideline S2(R1) ʻGuidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use S2(R1)ʼ is chosen to identify all genotoxic compounds. The standard testing battery is less applicable in the early discovery phase of drug development because of the low throughput and the high compound demand. Furthermore, the in vitro mammalian tests imply a relatively low specificity. For a complete safety assessment in vivo carcinogenicity testing is needed. Unfortunately, these tests are costly and time-consuming. Therefore, various research approaches aim to improve predicitivity and to detect the genotoxic potential in the early discovery phase of drug development. The high content imaging (HCI) technology offers an approach to improve throughput compared to the standard testing battery. In addition, a cell-based model using HCI has the advantage of generating data rapidly with small compound needs. Therefore, HCI-based assays would enable screening in the early discovery phase of pharmaceutical drug development. This study aimed to develop a novel, specific and sensitive HCI-based test system for mutagens and promutagens in vitro using HepG2 cells. Due to their limited metabolic capacity, a combined system of HepG2 cells and metabolic activation system has been established for promutagen testing. Based on previous whole-genome expression profiling (Boehme et al., 2011) and literature research the following nine different proteins involved in DNA-damage response were chosen as putative markers for compound-induced genotoxicity: p-p53 (Ser15), p21, p-H2A.X (Ser139), p-Chk1 (Ser345) p-ATM (Ser1981), p-ATR (Ser428), p-CDC2 (Thr14/ Tyr15), GADD45A and p-Chk2 (Thr68). The protein expression or activation changes of these markers were quantified 48 h after treatment with (pro-)genotoxicants (Cyclophosphamide, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene, Aflatoxin B1, 2-Acetylaminofluorene, Methylmethane sulfonate, Actinomycin D, Etoposide) and non-genotoxicants (D-mannitol, Phenfomin hydrochloride, Progesterone) using the HCI technology. The best classification was achieved using the following five out of the nine putative marker proteins: p-p53 (Ser15), p21, p-H2A.X (Ser139), p-Chk1 (Ser345) and p-ATM (Ser1981)