Über den Einfluss von Melittin auf die Funktion membranständiger Proteasen der ADAM-Familie

Melittin, Hauptbestandteil des Bienengifts, ist ein kationisches Peptid, welches in der Lage ist, die biophysikalischen Eigenschaften der Zellmembran zu beeinflussen. Melittin werden unter anderem auch entzündungshemmende, schmerzlindernde, anti-rheumatische und anti-arthritische Wirkungen zugeschrieben. rnIn dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass Melittin die Proteolyse von ADAM10- und ADAM17-Substraten in verschiedenen Zellen stimuliert. Durch das Sheddingvon TGF-α wurde in HaCaT-Keratinozyten eine Transaktivierung des EGF-Rezeptors und eine daraus resultierende Phosphorylierung der Kinase ERK1/2 beobachtet. Die durch Melittin gesteigerte Aktivität der ADAMs ist calciumunabhängig und wird nicht durch Änderungen in der Membranfluidität verursacht. Eine Beteiligung der P2-Rezeptoren an der Melittin-induzierten ADAM-Aktivierung konnte sowohl durch Inhibition der Rezeptoren als auch durch Transfektion von HEK-Zellen mit dem P2X7-Rezeptor nachgewiesen werden. In diesen wurde nach der Behandlung mit Melittin eine Phosphorylierung von ERK1/2 beobachtet, welche durch ATPasen und P2-Rezeptor-Inhibitoren unterdrückt werden konnte. rnMit Hilfe des Kaninchenerythrozyten-Modells wurde nachgewiesen, dass eine Translokation von Phosphatidylserin von der Innen- zur Außenseite der Membran unmittelbar mit einer erhöhten ADAM-Aktivität korreliert. Sowohl durch Aktivierung des P2X7-Rezeptors als auch durch die Behandlung der Zellen mit dem Ionophor A23187 konnte ein Phosphatidylserin-Flip induziert werden. Dieser Flip führte zu einer erhöhten Aktivität von ADAM10, die durch eine gesteigerte Hämolyse und Spaltung von pVCC nachgewiesen werden konnte. Wurde der Phosphatidylserin-Flip durch Inhibitoren des P2X7-Rezeptors bzw. die Chelation von Ca2+ und Hemmung der Ionenfluxe unterdrückt, blieb auch die erhöhte ADAM-Aktivität aus. Wurde dagegen der Phosphatidylserin-Flip erst induziert und nachträglich die Inhibition des P2X7-Rezeptors bzw. die Chelation von Ca2+ und Hemmung der Ionenfluxe durchgeführt, zeigte dies keine Inhibition der ADAM-Aktivität.rnZusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass eine Exposition von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Membran in einem kausalen Zusammenhang mit einer gesteigerten ADAM-Aktivität steht.rnThe major component of bee venom is melittin, a cationic peptide which is able to influence the biophysical properties of the cell membrane. Melittin is said to exert anti-inflammatory, pain-relieving, anti-rheumatoid and anti-arthritic effects.rnThis work shows that melittin stimulates proteolysis of ADAM10 and ADAM17 substrates in different cells.The shedding of TGF-α induced EGFR phosphorylation with downstream activation of ERK1/2 in HaCaT keratinocytes.The increased activity of ADAMs by melittin is calcium independent and not caused by changes of membrane fluidity. The involvement of P2 receptors in the melittin-induced ADAM activation could be detected by inhibition of the receptors as well as by transfecting HEK cells with the P2X7-receptor. After treatment with melittin, phosphorylation of ERK1/2 was observed which could be suppressed by ATPases and P2 receptor inhibitors. rnBy using the rabbit erythrocyte model, it could be demonstrated that a translocation of phosphatidylserine from the inside to the outside of the cell membrane correlates directly with the increased ADAM activity. Activation of the P2X7 receptor as wells as treatment of cells with ionophore A23187 could induce a phosphatidylserine flip. This flip led to enhanced ADAM10 activity, which could be detected through increased hemolysis and cleavage of pVCC. When the PS-flip was suppressed with inhibitors of the P2X receptor or through the chelation of Ca2+ and inhibition of the ion fluxes, increased ADAM activity could not be observed. If, however, the phosphatidylserine flip was induced first with subsequent inhibition of the P2X7 receptor or chelation of Ca2+ and inhibition of the ionic fluxes, no inhibition of ADAM activity occurred.rnIn sum, these results show that exposure of phosphatidylserine on the outside of the cell membrane is directly linked to an increased ADAM activity. r