Aktivierung von c-Jun-N-terminalen Kinasen (SAPK,JNK) als Teil der späten Cisplatin abhängigen DNA-Schadensantwort

Stress-aktivierte-Protein-Kinasen (c-Jun-N-terminal kinases) SAPK/JNK werden sehr schnell nach Exposition von Zellen mit verschiedensten Noxen, wie beispielsweise Genotoxinen, aktiviert. Sie sind allerdings noch nicht als Teil der DNA-Schadensantwort etabliert. In dieser Arbeit sollte gezeigt werden, das SAPK/JNK einen wichtigen Teil innerhalb der DNA-Schadensantwort spielen. Aus diesem Grund wurde zu frühen (z.B.: 4 h) als auch zu späten Zeiten (z.B.: 24 h) die Bildung von DNA-Addukten nach Cisplatin Exposition untersucht und überprüft, ob diese mit dem Aktivierungsstatus der SAPK/JNK nach Cisplatinbehandlung korreliert. Menschliche Fibroblasten, die einen Defekt in der Transkription gekoppelten Nukleotid-Exzisionsreparatur (TC-NER) aufwiesen, wie beispielsweise CSB-Zellen (Cockayne Syndrom B) oder XPA-Zellen (Xeroderma Pigmentosum A), sind charakterisiert durch einen erhöhten Phosphorylierungsstatus der SAPK/JNK, 16 h nach Cisplatingabe, im Vergleich zu normalen Wildtyp-Fibroblasten. Die nach Cisplatin Exposition beobachtete Aktivierung der SAPK/JNK ist quantitativ jedoch nicht vergleichbar mit dem Level an gebildeten Cisplatin-DNA-Addukten, wie in den Southwestern- und Massenspektrometrischen Untersuchungen gezeigt werden konnte. Es konnten jedoch Parallelen zwischen der Aktivierung der SAPK/JNK, sowie den gezeigten γ-H2AX-Foci als auch der Aktivierung von Check-Point Kinasen gefunden werden. Dies lässt darauf schließen, dass DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) an der späten Aktivierung des SAPK/JNK Signalweges beteiligt sind. Dementsprechend lässt sich ebenfalls in Zellen, die einen Defekt in der Reparatur von Doppelstrangsbrüchen aufweisen, wie beispielsweise DNA-PKcs Zellen, eine erhöhte, durch Cisplatin hervorgerufene späte Phosphorylierung der SAPK/JNK als auch eine vermehrte γ-H2AX-Foci Bildung und Check-Point Kinasen Aktivierung nachweisen. Vergleichend dazu zeigten Zellen mit einem Defekt in ATM (Ataxia telegiectasia mutated protein) oder XPC keine erhöhte Phosphorylierung zu späten Zeiten nach Cisplatin Behandlung. Weiterhin bleibt festzuhalten, dass die späte, durch Cisplatin hervorgerufene Schadensantwort unabhängig von p53, ER-Stress oder MKP-1 ist. Die SAPK/JNK Aktivierung nach Cisplatin Exposition erfordert funktionsfähige Rho-GTPasen und kann durch pharmakologische Hemmung der Tyrosin-Kinasen und durch N-Acetylcystein gehemmt werden. Es lässt sich zusammenfassend sagen, dass die durch Cisplatin induzierte späte SAPK/JNK Aktivierung durch die Formation von DSB initiiert wird und XPC, Rho-Proteine sowie Tyrosin Kinasen an der Signalweiterleitung beteiligt sind.Stress activated protein kinases (c-Jun-N-terminal kinases) SAPK/JNK are rapidly activated by various genotoxins but are not yet established as part of the DNA damage response. Here we show that the level of cisplatin-induced DNA adducts correlated with the activation status of SAPK/JNK both at early (i.e. 4 h) and late (i.e. 24 h) time points after exposure. Human cells deficient in transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) due to lack of CSB (Cockayne Syndrom B) or XPA (Xeroderma Pigmentosum A) protein are characterized by an enhanced phosphorylation status of SAPK/JNK 16-24 h after cisplatin treatment as compared to corresponding wild-type cells. Ameliorated late SAPK/JNK activation in CSB defective cells is not paralleled by the level of Cisplatin DNA adducts as determined by mass spectrometry and southwestern analysis. Yet, it is paralleled by enhanced γH2AX foci formation and checkpoint activation, indicating DNA double strand breaks (DSB) being involved in triggering late signalling to SAPK/JNK. Correspondingly, cells deficient in the repair of DSB due to a defect in DNA-PKcs showed elevated cisplatin-induced late phosphorylation of SAPK/JNK as well as ameliorated γH2AX foci formation and checkpoint activation. Cells defective in ATM (Ataxia telangiectasia) or XPC (Xeroderma Pigmentosum C) protein do not reveal increased SAPK/JNK activation at late time point after cisplatin treatment. Cisplatin-induced late damage response in CSB cells is independent of both p53, MKP-1 and ER-stress. It requires functional Rho GTPases and can be attenuated by pharmacological inhibition of tyrosine kinase activity and by N-acetylcystein. Summarizing, we identified SAPK/JNK as a novel player in the late DNA damage response to cisplatin. Cisplatin-induced late SAPK/JNK activation seems to be triggered by the formation of DSB and furthermore, involves XPC and Rho proteins as well as tyrosine kinases