Nanoparticles for efficient uptake by human dendritic cells and T lymphocytes to be used in adoptive immunotherapy

Dendritic cells (DCs) are the most potent cell type for capture, processing, and presentation of antigens. They are able to activate naïve T cells as well as to initiate memory T-cell immune responses. T lymphocytes are key elements in eliciting cellular immunity against bacteria and viruses as well as in the generation of anti-tumor and anti-leukemia immune responses. Because of their central position in the immunological network, specific manipulations of these cell types provide promising possibilities for novel immunotherapies. Nanoparticles (NP) that have just recently been investigated for use as carriers of drugs or imaging agents, are well suited for therapeutic applications in vitro and also in vivo since they can be addressed to cells with a high target specificity upon surface functionalization. As a first prerequisite, an efficient in vitro labeling of cells with NP has to be established. In this work we developed protocols allowing an effective loading of human monocyte-derived DCs and primary antigen-specific T cells with newly designed NP without affecting biological cell functions. Polystyrene NP that have been synthesized by the miniemulsion technique contained perylenmonoimide (PMI) as a fluorochrome, allowing the rapid determination of intracellular uptake by flow cytometry. To confirm intracellular localization, NP-loaded cells were analyzed by confocal laser scanning microscopy (cLSM) and transmission electron microscopy (TEM). Functional analyses of NP-loaded cells were performed by IFN-γ ELISPOT, 51Chromium-release, and 3H-thymidine proliferation assays. In the first part of this study, we observed strong labeling of DCs with amino-functionalized NP. Even after 8 days 95% of DCs had retained nanoparticles with a median fluorescence intensity of 67% compared to day 1. NP loading did not influence expression of cell surface molecules that are specific for mature DCs (mDCs) nor did it influence the immunostimulatory capacity of mDCs. This procedure did also not impair the capability of DCs for uptake, processing and presentation of viral antigens that has not been shown before for NP in DCs. In the second part of this work, the protocol was adapted to the very different conditions with T lymphocytes. We used leukemia-, tumor-, and allo-human leukocyte antigen (HLA) reactive CD8+ or CD4+ T cells as model systems. Our data showed that amino-functionalized NP were taken up very efficiently also by T lymphocytes, which usually had a lower capacity for NP incorporation compared to other cell types. In contrast to DCs, T cells released 70-90% of incorporated NP during the first 24 h, which points to the need to escape from intracellular uptake pathways before export to the outside can occur. Preliminary data with biodegradable nanocapsules (NC) revealed that encapsulated cargo molecules could, in principle, escape from the endolysosomal compartment after loading into T lymphocytes. T cell function was not influenced by NP load at low to intermediate concentrations of 25 to 150 μg/mL. Overall, our data suggest that NP and NC are promising tools for the delivery of drugs, antigens, and other molecules into DCs and T lymphocytes.Dendritische Zellen (DCs) sind die wichtigsten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems. Sie aktivieren naive T-Zellen und veranlassen die Bildung von Gedächtnis T-Zellen. T-Lymphozyten vermitteln Immunität gegen Viren und Bakterien und sind in der Lage, anti-tumorale und anti-leukämische Antworten zu generieren. Die zentrale Stellung dieser beiden Zelltypen im immunologischen Netzwerk macht sie zu einem vielversprechenden Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Immuntherapien. Seit einigen Jahren stehen Nanopartikel (NP) vermehrt im Focus biomedizinscher Forschung, da diese als Transportvehikel für Therapeutika und Reportersubstanzen eingesetzt und durch Oberflächenfunktionalisierung an bestimmte Zellpopulationen adressiert werden können. Als Grundvoraussetzung muss jedoch zunächst eine effiziente Beladung der Zellen mit NP in vitro etabliert werden. Gegenstand dieser Arbeit ist die Entwicklung von in vitro Protokollen zur bestmöglichen Beladung von humanen DCs und T-Zellen mit eigens hergestellten NP ohne deren immunbiologische Funktionalität zu beeinträchtigen. Die verwendeten, mittels Miniemulsion synthetisierten Polystyrol-NP enthalten Perylenmonoimid (PMI) als Fluorochrom, wodurch die Aufnahme in Zellen durchflusszytometrisch quantifiziert werden kann. Die intrazelluläre Lokalisation der NP wurde mit Hilfe von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (cLSM, TEM) überprüft. NP-beladene Zellen wurden in IFN-γ ELISPOT Assays, 51Chrom-Zytotoxizitätstests und 3H-Thymidin Proliferationstests funktionell evaluiert.rnIm ersten Teil dieser Arbeit konnte eine effektive Beladung von DCs (generiert aus Monozyten des peripheren Bluts) mit aminofunktionalisierten NP für mindestens 8 Tage erzielt werden, wobei noch 95% der gelabelten Zellen NP besaßen und eine mediane Fluoreszenzintensität von 67% des initialen Wertes aufwiesen. Aufgenommene NP beeinflussten weder die Expression spezifischer Oberflächenmarker reifer DCs (mDCs), noch wurde die Fähigkeit zur Aufnahme, Prozessierung und Präsentation viraler Antigene beeinträchtigt. Dies konnte erstmalig für NP in DCs gezeigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Protokoll an die unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen von antigenspezifischen T-Lymphozyten angepasst. Als Modellsysteme wurden sowohl leukämie- und tumorreaktive als auch alloreaktive, gegen humane Leukozytenantigene (HLA) gerichtete T-Zellen verwendet. Obwohl T-Zellen im Vergleich zu anderen Zellen nur über eine geringe Aufnahmekapazität für NP verfügen, ist es uns dennoch gelungen, diese ebenfalls effizient mit aminofunktionalisierten NP zu beladen. Da jedoch 70-90% der aufgenommenen NP bereits innerhalb 24 h wieder abgeben wurden, müssen Strategien entwickelt werden, die den NP den Transfer aus dem endolysosomalen Kompartiment in das Zytosol ermöglichen. Erste Ergebnisse mit bioabbaubaren Nanokapseln (NC) zeigen, dass darin verkapselte Moleküle nach NC-Aufnahme prinzipiell dazu in der Lage sind. Die Effektorfunktionen der T-Zellen wurden durch niedrige bis mittlere NP-Konzentrationen zwischen 25 - 150 μg/mL nicht beeinträchtigt. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit legen nahe, dass sich polymere NP und NC prinzipiell sehr gut als Vehikel für die Einschleusung von Therapeutika, Antigenen und Reportersubstanzen in DCs und T-Zellen eignen