Aktivität der humanen Meprin-Metalloproteasen unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren

Die Metalloproteasen Meprin α und Meprin β sind an essentiellen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt. Um die Funktion dieser Proteasen zu verstehen, ist es von Bedeutung, sie nicht isoliert, sondern im gesamten proteolytischen Netzwerk zu betrachten.rnDie Meprine werden in einer Vielzahl von Geweben, in Leukozyten, aber auch in Krebszellen exprimiert. In der Haut konnten die beiden Enzyme in unterschiedlichen dermalen Schichten detektiert werden, wo sie u.a. an der Kollagenassemblierung durch Abspaltung der Propeptide beteiligt sind. rnIm Zuge von Proteomics Analysen konnten mehr als 3000 proteolytische Schnittstellen von fünf Astacin-Metalloproteasen (Meprin α, Meprin β, Astacin, LAST und LAST_MAM) in Peptiden und nativen Substraten identifiziert werden und somit eine Aussage über die Spaltspezifität getroffen werden. In der vorliegenden Arbeit konnten diese Spaltspezifitäten mit Hilfe von fluorogenen Substraten in vitro verifiziert werden. Bemerkenswert hierbei ist die starke Präferenz der beiden Meprine und LAST_MAM für die Aminosäuren Aspartat und Glutamat in der P1‘ Position. rnMeprine werden als Zymogene exprimiert und müssen durch proteolytische Prozessierung einer tryptischen Protease aktiviert werden. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit waren Aktivitätsbestimmungen beider Meprine unter Berücksichtigung potentieller Aktivatoren und Substrate. Es konnten die kallikrein-related peptidases (KLK) 4, 5 und 8 als spezifische Aktivatoren identifiziert werden, wobei nur KLK5 beide Proteasen aktiviert. Sowohl KLK4 als auch KLK8 sind lediglich in der Lage, das Propeptid von Meprin β abzuspalten. Außerdem konnte biochemisch und mittels Proteomics gezeigt werden, dass proKLK7 von Meprin β prozessiert wird. Durch N-terminale Sequenzierung wurde eine Schnittstelle zwei Aminosäuren N-terminal der eigentlichen Aktivierungsstelle identifiziert. Dieser Schritt beschleunigt die Aktivierung von KLK7, wenn durch Trypsin noch das verbliebene Dipeptid abgespalten wird. rnDa einige Vertreter der humanen kallikrein-related peptidases (KLK) als Meprin-Aktivatoren identifiziert werden konnten, sollten diese im Zuge dieser Arbeit im Modellorganismus Danio rerio untersucht werden. Durch in silico und RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass keine funktionellen KLK-Homologe im Zebrafisch codiert sind. Da somit andere tryptische Proteasen an der Aktivierung der Meprine beteiligt sein müssen, wurde die Transmembran-Serinprotease TMPRSS4 analysiert. In der Tat zeigte die Reduktion des Expressionslevels von TMPRSS4 durch Morpholino-Injektion drastische Störungen in der embryonalen Entwicklung von Zebrabärblingen. Mittels Licht- und Rasterelektronenmikroskopie ließ sich eine Fehlbildung der epidermalen Haut bis zu einem Ablösen der Keratinozyten von dem darunter liegenden Gewebe feststellen. rnThe metalloproteases Meprin α and Meprin β are essential players in (patho)physiological processes. To understand their function in health and disease, it is crucial to study not only the individual proteases but also their relations within the entire proteolytic web. rnMeprins are expresses in several tissues, leucocytes and a variety of cancer cells. In skin, they are located in separate layers of human epidermis, and in dermal fibroblasts, being involved in collagen assembly by propeptide cleavage.rnUsing degradomics approaches more than 3,000 cleavage sites were proteomically identified for five astacin metalloproteases (Meprin α, Meprin β, Astacin, LAST und LAST_MAM), revealing their cleavage specificities. In this work, we were able to validate these cleavage specificities using fluorogenic peptide substrates. Remarkably, Meprin α, Meprin β and LAST_MAM proteases exhibit a strong preference for aspartate and glutamate in the P1’ position, unique amongst all extracellular proteases.rnMeprins are secreted as zymogens that are activated by tryptic proteolytical processing. Here we identified human kallikrein-related peptidases (KLKs) 4, 5 and 8 to be specific activators of Meprins. KLK5 is capable of activating both metalloproteases. Interestingly, KLK4 and 8 cleave off the propeptide of meprin β only. Moreover, biochemical analysis and proteomics tools show that proKLK7 is processed by meprin β. N-terminal sequencing revealed cleavage two amino acids N-terminal to mature KLK7. Interestingly, this triggering led to an accelerated activation of the serine protease in the presence of trypsin. rnSince human KLKs could be identified as potential activators for meprins our aim was to investigate meprin activation in the suitable model organism Danio rerio. However, in situ and RT-PCR analysis revealed no functional KLK homologues in zebrafish. Hence, other tryptic proteases must be involved in meprin activation, and therefore we analysed the transmembrane serine protease TMPRSS4. Indeed, the in vivo gene silencing by morpholino injection caused severe defects of zebrafish embryonic development. Using light microscopy and scanning electron microscopy a disturbed epidermal skin organization, with clearly altered cell-cell-contacts, resulting in the detachment of keratinocytes from the underneath tissue, could be observed. r