Entwicklung eines pharmakologischen Modells zur Prüfung immuntherapeutischer Antikörper mit dreidimensionalen Tumorzellkulturen in vitro

In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Präparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunächst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mögliche Gefahren so beurteilen zu können, dass sie für einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur präklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskuläre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, führt zu wesentlich besseren Voraussagen bezüglich der klinischen Wirksamkeit neuer Präparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikörper für die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Präparate übertragen lässt.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika ständig frei zirkulieren, sind besonders für eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von ≥20 Tagen für eine große Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmäßig durchführbaren Analysemethoden zählen unter anderem immunhistochemische Färbungen an Sphäroid-Gefrierschnitten, Vitalitätstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphäroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienüberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur präklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zukünftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prüfungen einen festen Platz einnehmen könnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikörper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab® für die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prüfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikörper besitzen im Gegensatz zu herkömmlichen monoklonalen Antikörpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazität, über welche sie an Fcγ RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermöglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der körpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikörper eine Größenreduktion der Sphäroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Maße bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhängig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphäroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhängig auf die Reduktion der Sphäroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstärkte Ausschüttung der Zytokine IL-2, IFN-γ und TNF-α hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass catumaxomab die zelluläre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafür Zytostatika mit dem unerwünschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikörper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zusätzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gängigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgeführt. Mit Untersuchungen der Sphäroidvolumina, Vitalitätstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstärkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrnOver the last years, immunological therapeutics have gained more and more significance in tumor treatment. Testing of potential new drug candidates routinely involves cell culture and animal experiments to analyze the drug’s efficacy and safety, as well as possible degradation pathways and dangers for the patients. In general, preclinical in vitro studies make use of monolayer cell culture systems or single cell suspensions. The employment/application of three-dimensional (3D) cell culture models which mirror micrometastases or intervascular areas in tumors more accurately lead to a much better prognosis with regard to clinical efficacy. The aim of this study was to develop and employ a new 3D cell culture-based system for the trial of trifunctional bispecific antibodies in tumor treatment, which then can also be ap-plied to similar drugs.rnIn my thesis, I was able to define several human tumor cell lines with which it was possible to establish stable co-cultures of Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) combined with Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturized spinner flasks. In these spinner flasks, immune cells, tumor spheroids, and therapeu-tics can constantly circulate freely, which is well suited to realistically mimic the in vivo situation of disseminated tumor cells or malign ascites. This way of cultivation allows for a monitoring period of 20 days and more with a great bandwidth of analyti-cal methods. Among others, these multiple observation techniques include immuno-histochemical stainings of spheroid cryosections, cell viability assays, plating effi-ciency experiments, volume growth analysis, cytokine measurements from media supernatants with Cytokine Bead Arrays, PCR analyses from immune cell specific antigens, as well as flow cytometric analyses of single cell populations. This combi-nation allows for a very detailed insight into the efficacy and underlying mode of ac-tions of new immunotherapeutics from different perspectives, and it represents a pre-cise and reproducible test system under standardized conditions for preclinical stud-ies, which in the future might serve as a powerful link between monolayer cell cul-tures and clinical studies. rnUsing this novel approach, the trifunctional bispecific antibodies catumaxomab (already approved as a treatment for malign ascites under the name Removab®) and ertumaxomab (currently tested in clinical trials) were analyzed with respect to their efficacy and mode of action. In contrast to conventional monoclonal antibodies, both catumaxomab and ertumaxomab possess two different binding sites: one against CD3 on T-cells, the other against EpCAM or Her2/neu, respectively, - both are wide-spread tumor antigens. Their Fc-part comprises a third binding capacity, through which they can bind to Fcγ RI, -IIa, and -III positive accessory cells. In theory, this combination enables the formation of a tri-cell-complex consisting of a T-cell, a tumor cell and an accessory cell. Thus, trifunctional bispecific antibodies represent an effec-tive treatment option by using the body’s own immunological defenses. rnWithin the scope of this thesis, I was able to show that both antibodies to the same degree cause a reduction in volume of spheroids expressing the corresponding antigens, and the plating efficiency under ertumaxomab treatment was reduced in a dose dependent manner. Furthermore, catumaxomab’s mode of action on spheroids of the tumor cell line FaDu (head and neck squamous cell carcinoma) could be ana-lyzed in more detail: catumaxomab caused a volume reduction of the spheroids in a dose-dependent manner, and an increasing infiltration of CD45+ cells, which could be further identified as T-, NK- and/or dendritic cells. Moreover, treatment with catu-maxomab initiated the increased release of IL-2, IFN-γ, and TNF-α. These results indicate the activation of the cellular immune response by catumaxomab.rnConventional tumor treatment involves the administration of chemotherapeu-tics. In general, this includes the usage of cytostatics, which often have the unwanted side effect of also affecting healthy proliferating cells. In principal, this can influence the effectiveness of a given immunological treatment. Therefore, comparative studies with catumaxomab and a common cytostatic – Cisplatin – were performed in this thesis. By evaluating the reduction in spheriod volume, cell viability assays, and plat-ing efficiency experiments, it could be demonstrated that the efficacy of catu-maxomab under simultaneous treatment with both therapeutics was maintained and even enhanced. Thus, an adjunction with immunological therapeutics and cytostatics in human patients seems to be feasible