Strukturbildung durch Selbstorganisation von Oligonukleotiden

Die DNA-Doppelhelix ist eine relativ dicke (Ø ≈ 2 nm), kompakte und dadurch auf kurzen Längenskalen relativ steife Verbindung (lp[dsDNA] ≈ 50-60 nm), mit einer klar definierten Struktur, die durch biologische Methoden sehr präzise manipuliert werden kann. Die Auswirkungen der primären Sequenz auf die dreidimensionale Strukturbildung ist gut verstanden und exakt vorhersagbar. Des Weiteren kann DNA an verschiedenen Stellen mit anderen Molekülen verknüpft werden, ohne dass ihre Selbsterkennung gestört wird. Durch die helikale Struktur besteht außerdem ein Zusammenhang zwischen der Lage und der räumlichen Orientierung von eingeführten Modifikationen. Durch moderne Syntheseverfahren lassen sich beliebige Oligonukleotidsequenzen im Bereich bis etwa 150-200 Basen relativ preiswert im Milligrammmaßstab herstellen. Diese Eigenschaften machen die DNA zu einem idealen Kandidaten zur Erzeugung komplexer Strukturen, die durch Selbsterkennung der entsprechenden Sequenzen gebildet werden. In der hier vorgelegten Arbeit wurden einzelsträngige DNA-Abschnitte (ssDNA) als adressierbare Verknüpfungsstellen eingesetzt, um verschiedene molekulare Bausteine zu diskreten nicht periodischen Strukturen zu verbinden. Als Bausteine dienten flexible synthetische Polymerblöcke und semiflexible Doppelstrang-DNA-Abschnitte (dsDNA), die an beiden Enden mit unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen „funktionalisiert“ sind. Die zur Verknüpfung genutzten Oligonukleotidabschnitte wurden so gewählt (n > 20 Basen), dass ihre Hybridisierung zu einer bei Raumtemperatur stabilen Doppelstrangbildung führt. Durch Kombination der Phosphoramiditsynthese von DNA mit einer festkörpergestützten Blockkopplungsreaktion konnte am Beispiel von Polyethylenoxiden ein sehr effektiver Syntheseweg zur Herstellung von ssDNA1-PEO-ssDNA2-Triblockcopolymeren entwickelt werden, der sich problemlos auf andere Polymere übertragen lassen sollte. Die Längen und Basenabfolgen der beiden Oligonukleotidsequenzen können dabei unabhängig voneinander frei gewählt werden. Somit wurden die Voraussetzungen geschaffen, um die Selbsterkennung von Oligonukleotiden durch Kombination verschiedener Triblockcopolymere zur Erzeugung von Multiblockcopolymeren zu nutzen, die mit klassischen Synthesetechniken nicht zugänglich sind. Semiflexible Strukturelemente lassen sich durch die Synthese von Doppelstrangfragmenten mit langen überstehenden Enden (sticky-ends) realisieren. Die klassischen Ansätze der molekularen Genetik zur Erzeugung von sticky-ends sind in diesem Fall nicht praktikabel, da sie zu Einschränkungen im Bezug auf Länge und Sequenz der überhängenden Enden führen. Als Methode der Wahl haben sich zwei verschiedene Varianten der Polymerase Kettenreaktion (PCR) erwiesen, die auf der Verwendung von teilkomplementären Primern beruhen. Die eigentlichen Primersequenzen wurden am 5´-Ende entweder über ein 2´-Desoxyuridin oder über einen kurzen Polyethylenoxid-Spacer (n = 6) mit einer frei wählbaren „sticky-end-Sequenz“ verknüpft. Mit diesen Methoden sind sowohl 3´- als auch 5´-Überhänge zugänglich und die Länge der Doppelstrangabschnitte kann über einen breiten Molmassenbereich sehr exakt eingestellt werden. Durch Kombination derartiger Doppelstrangfragmente mit den biosynthetischen Triblockcopolymeren lassen sich Strukturen erzeugen, die als Modellsysteme zur Untersuchung verschiedener Biomoleküle genutzt werden können, die in Form eines mehrfach gebrochenen Stäbchens vorliegen. Im letzten Abschnitt wurde gezeigt, dass durch geeignete Wahl der überstehenden Enden bzw. durch Hybridisierung der Doppelstrangfragmente mit passenden Oligonukleotiden verzweigte DNA-Strukturen mit Armlängen von einigen hundert Nanometern zugänglich sind. Im Vergleich zu den bisher veröffentlichten Methoden bietet diese Herangehensweise zwei entscheidende Vorteile: Zum einen konnte der Syntheseaufwand auf ein Minimum reduziert werden, zum anderen ist es auf diesem Weg möglich die Längen der einzelnen Arme, unabhängig voneinander, über einen breiten Molmassenbereich zu variieren.The DNA double helix is a relatively thick (Ø ≈ 2 nm), compact and therefore a stiff molecule on short length scales (lp[dsDNA] ≈ 50-60 nm). It features a well defined structure which can be manipulated very precisely by biological techniques. The relation between the three-dimensional structure and the primary sequence is well understood and exactly predictable. Furthermore, it is possible to connect other molecules to different positions of the DNA without disturbing the self recognition of complementary sequences. In consequence of the helical structure, there is a correlation between the position an the spatial orientation of those modifications. With modern techniques, milligrams of any single stranded sequence in the range of up to 150-200 bases are commercially available. Due to those characteristics DNA is an ideal choice to create complex structures by means of self assembly. The objective of this work was to use single stranded DNA (ssDNA) as an addressable linker which is able to connect different molecular building blocks to discrete non periodic structures. Completely flexible synthetic polymers as well as semi flexible double stranded DNA (dsDNA) which were „functionalized“ on both ends with different oligonucleotide sequences have been used as building blocks. Oligonucleotide moieties with sufficient length (n > 20 bases) were chosen in order to end up with a connecting double helix which is stable at room temperature. By combining the phosphoramidit synthesis of DNA with a solid supported block coupling reaction of polyethylene oxide, a very efficient route to ssDNA1-PEO-ssDNA2-triblock copolymers has been developed, which should be easily transferable to other synthetic polymers. With this method it is possible to freely chose length and base composition of both oligonucleotides separately. Hence, the fundamental components were established to connect different triblock copolymers by self recognition of oligonucleotides in order to obtain multi block copolymer structures that are not accessible by classical chemical synthesis. Semi flexible building blocks were realized by the formation of long single stranded overhangs (sticky-ends) on both sides of a double stranded DNA fragment. In this case typical methods of molecular genetics that are frequently used to introduce sticky-ends are not viable as they would lead to restrictions concerning length and sequence of those overhangs. Two different versions of polymerase chain reaction (PCR) have been proven to be the methods of choice. Both of them rely on modified primers whose 3´-parts of the sequence are complementary to the target but the 5´-parts are not. The 5´-end of the real primer sequence is connected either by 2´-desoxyuridin or by a short polyethylene oxide spacer (n = 6) to a freely chooseable sticky-end-sequence. With those primers 3´- as well as 5´-overhangs are accessible and the length of the double stranded part can be tuned very precisely over a broad range of molar masses. By combination of those double stranded fragments with the above mentioned biosynthetic triblock copolymers it is possible to create structures that may serve as a model system for several biomolecules that feature the structure of a multi broken rod. Within the last chapter of this thesis it is shown how to create branched DNA structures either by using appropriate sticky-ends as well as by combination of dsDNA fragments with suitable oligonucleotides. Those structures have a star like shape with four arms (each of which) that have a contour length of several hundred nanometers. Compared to already published methodologies the presented approach has two major advantages: on the one hand the operating expense has been reduced to a minimum, on the other hand it is easily possible to tune the contour length of each arm separately about a broad range of molar masses