Automatisierte Flüssigchromatographie mit Säulenschaltung und Ultraviolettspektroskopie oder Massenspektrometrie für therapeutisches Drug Monitoring von Antipsychotika und Antidepressiva

Therapeutisches Drug Monitoring (TDM) wird zur individuellen Dosiseinstellung genutzt, um die Effizienz der Medikamentenwirkung zu steigern und das Auftreten von Nebenwirkungen zu senken. Für das TDM von Antipsychotika und Antidepressiva besteht allerdings das Problem, dass es mehr als 50 Medikamente gibt. Ein TDM-Labor muss dementsprechend über 50 verschiedene Wirkstoffe und zusätzlich aktive Metaboliten messen. Mit der Flüssigchromatographie (LC oder HPLC) ist die Analyse vieler unterschiedlicher Medikamente möglich. LC mit Säulenschaltung erlaubt eine Automatisierung. Dabei wird Blutserum oder -plasma mit oder ohne vorherige Proteinfällung auf eine Vorsäule aufgetragen. Nach Auswaschen von störenden Matrixbestandteilen werden die Medikamente auf einer nachgeschalteten analytischen Säule getrennt und über Ultraviolettspektroskopie (UV) oder Massenspektrometrie (MS) detektiert. Ziel dieser Arbeit war es, LC-Methoden zu entwickeln, die die Messung möglichst vieler Antipsychotika und Antidepressiva erlaubt und die für die TDM-Routine geeignet ist. Eine mit C8-modifiziertem Kieselgel gefüllte Säule (20 µm 10x4.0 mm I.D.) erwies sich in Vorexperimenten als optimal geeignet bezüglich Extraktionsverhalten, Regenerierbarkeit und Stabilität. Mit einer ersten HPLC-UV-Methode mit Säulenschaltung konnten 20 verschiedene Psychopharmaka einschließlich ihrer Metabolite, also insgesamt 30 verschiedene Substanzen quantitativ erfasst werden. Die Analysenzeit betrug 30 Minuten. Die Vorsäule erlaubte 150 Injektionen, die analytische Säule konnte mit mehr als 300 Plasmainjektionen belastet werden. Abhängig vom Analyten, musste allerdings das Injektionsvolumen, die Flussrate oder die Detektionswellenlänge verändert werden. Die Methode war daher für eine Routineanwendung nur eingeschränkt geeignet. Mit einer zweiten HPLC-UV-Methode konnten 43 verschiedene Antipsychotika und Antidepressiva inklusive Metaboliten nachgewiesen werden. Nach Vorreinigung über C8-Material (10 µm, 10x4 mm I.D.) erfolgte die Trennung auf Hypersil ODS (5 µm Partikelgröße) in der analytischen Säule (250x4.6 mm I.D.) mit 37.5% Acetonitril im analytischen Eluenten. Die optimale Flussrate war 1.5 ml/min und die Detektionswellenlänge 254 nm. In einer Einzelprobe, konnten mit dieser Methode 7 bis 8 unterschiedliche Substanzen gemessen werden. Für die Antipsychotika Clozapin, Olanzapin, Perazin, Quetiapin und Ziprasidon wurde die Methode validiert. Der Variationskoeffizient (VK%) für die Impräzision lag zwischen 0.2 und 6.1%. Im erforderlichen Messbereich war die Methode linear (Korrelationskoeffizienten, R2 zwischen 0.9765 und 0.9816). Die absolute und analytische Wiederfindung lagen zwischen 98 und 118 %. Die für das TDM erforderlichen unteren Nachweisgrenzen wurden erreicht. Für Olanzapin betrug sie 5 ng/ml. Die Methode wurde an Patienten für das TDM getestet. Sie erwies sich für das TDM als sehr gut geeignet. Nach retrospektiver Auswertung von Patientendaten konnte erstmalig ein möglicher therapeutischer Bereich für Quetiapin (40-170 ng/ml) und Ziprasidon (40-130 ng/ml) formuliert werden. Mit einem Massenspektrometer als Detektor war die Messung von acht Neuroleptika und ihren Metaboliten möglich. 12 Substanzen konnten in einem Lauf bestimmt werden: Amisulprid, Clozapin, N-Desmethylclozapin, Clozapin-N-oxid, Haloperidol, Risperidon, 9-Hydroxyrisperidon, Olanzapin, Perazin, N-Desmethylperazin, Quetiapin und Ziprasidon. Nach Vorreinigung mit C8-Material (20 µm 10x4.0 mm I.D.) erfolgte die Trennung auf Synergi MAX-RP C12 (4 µm 150 x 4.6 mm). Die Validierung der HPLC-MS-Methode belegten einen linearen Zusammenhang zwischen Konzentration und Detektorsignal (R2= 0,9974 bis 0.9999). Die Impräzision lag zwischen 0.84 bis 9.78%. Die für das TDM erforderlichen unteren Nachweisgrenzen wurden erreicht. Es gab keine Hinweise auf das Auftreten von Ion Suppression durch Matrixbestandteile. Die absolute und analytische Wiederfindung lag zwischen 89 und 107 %. Es zeigte sich, dass die HPLC-MS-Methode ohne Modifikation erweitert werden kann und anscheinend mehr als 30 verschiedene Psychopharmaka erfasst werden können. Mit den entwickelten flüssigchromatographischen Methoden stehen neue Verfahren für das TDM von Antipsychotika und Antidepressiva zur Verfügung, die es erlauben, mit einer Methode verschiedene Psychopharmaka und ihre aktiven Metabolite zu messen. Damit kann die Behandlung psychiatrischer Patienten insbesondere mit Antipsychotika verbessert werden.Therapeutic Drug Monitoring (TDM) that analyses drug concentrations in blood serum or plasma in association with clinical status of the patient is used for individual dose adjustment. It may increase the efficiency of a given medication and decrease the occurrence of side effects. The availability of TDM for antipsychotic or antidepressant drugs requires multiple assays for the more than 50 different compounds. Liquid chromatographic (LC) methods enable the determination on many drugs, using coulumn switching it is even possible to analyse serum or plasma samples automatically. Samples are injected on a clean-up column. After wash out of interfering matrix constituents, drugs are separated on an analytical column and detected by ultraviolet spectroscopy (UV) or mass spectrometry (MS). The aim of the present investigation was to develop LC-UV and LC-MS methods with column switching that enable the determination as many antipsychotic and antidepressant drugs as possible and that are suitable for routine TDM. C8 modified silica gel (20 µm 10x4.0 mm I.D.) was found to be optimal for sample clean-up. All drugs of interest were extracted. C8 material was also optimal in regard to regeneration and stability. A first HPLC-UV method enabled the determination of 20 different psychoactive drugs including metabolites. Analysis was completed within 30 minutes. Pre-columns allowed clean-up of about 150 samples, the analytical column more than 300 injections. To analyse the 20 different psychoactive compounds, however, sample volume, flow rate or detection wave length had to be varied depending on the compound to be analysed. The method was insufficient for routine use. A second HPLC-UV-method enabled determination of 43 different antipsychotic and antidepressant drugs and metabolites. After sample clean-up on C8-material (10 µm, 10x4 mm I.D.) by 8% acetonitrile, drugs were separated on Hypersil ODS (5 µm particle size 250x4.6 mm I.D.) by 37.5% acetonitrile. The optimal flow rate was 1.5 ml/min and the detection wavelength 254 nm. The method was well suitable for routine TDM. It enabled quantification of 7 to 8 different compounds in a single run. The assay was validated for clozapine, olanzapine, perazine, quetiapine and ziprasidone. Coefficients of variance ranged between 0.24 and 6.06% for imprecision. Correlation coefficients (R2) of drug concentration versus detector signal ranged between 0.9765 and 0.9816, the absolute and analytical recoveries between 98 and 118%. The lowest limit of quantification was 5 ng/ml (olanzapine). LC coupled to a mass spectrometric detector enabled the quantification of at least 12 different antipsychotic drugs plus metabolites in a single run or sample as shown for amisulpride, clozapine, N-desmethylclozapine, clozapine N-oxide, haloperidol, risperidone, 9-hydroxyrisperidone, olanzapine, perazine, N-desmethylperazine, quetiapine and ziprasidone. Deproteinized serum or plasma samples were cleaned up on C8 material and separted on Synergi MAX-RP C12 material (4 µm 150 x 4.6 mm Phenomenex). Validation of the LC-MS-method revealed linearity (R2 = 0.9974 to 0.9999). Imprecision ranged between 0,84 and 9,78%. The lower limits of detection were sufficient for routine TDM. The occurrence of ion suppression by matrix constituents was not observed. The absolute and analytical recoveries ranged between 98 and 118%. Further analyses revealed that the LC-MS-method could be extended without modification to more than other 30 different psychoactive drugs. When applying the validated HPLC-UV method to patients retrospective analyses of TDM data revealed therapeutic ranges could be derived for the new atypical antipsychotic drugs quetiapine (40-170 ng/ml) and ziprasidone (40-130 ng/ml). The established and validated liquid chromatographic methods with UV or MS detection were found to be suitable for analyses of antipsychotic and antidepressant drugs in plasma or serum. Using these methods for TDM they are helpful to improve psychopharmacotherapy