Ektopische Expression schwer exprimierbarer nikotinischer Acetylcholinrezeptoren in Zellinien

Deutsch:In dieser Arbeit wurden Versuche zur funktionellen Expression von schwer ektopisch exprimierbaren nAChR in HEK-293/a1-Zellen durchgeführt: a7 nAChR und a6-enthaltenden nAChR. Die Probleme lagen dabei nicht auf dem Niveau der Transfektion, Transkription, Translation oder der Assemblierung, sondern beim Transport der Rezeptoren zur Zellmembran.Die Expression von a7 nAChR in der Plasmamembran von HEK-293/a1-Zellen konnte durch verbesserte Expressionsbedingungen (Koexpression des Faltungshelfers Calnexin oder weiterer nAChR-Untereinheiten, Erniedrigung der Expressionstemperatur, Expression in Gegenwart nikotinischer Antagonisten) nicht erreicht werden. Auch in anderen Zellinien mit neuronalem oder nicht-neuronalem Ursprung (QT6, GH4C1, S2 und PCC7-Mz1) war die EGFP-gekoppelte a7 nAChR-Untereinheit nur im Zellinneren lokalisiert.Eine intrazelluläre Lokalisation verhinderte auch eine funktionelle Expression homomerer a6 sowie heteromerer a6b2 und a6b3 nAChR in HEK-293/a1-Zellen. Im Gegensatz dazu führte eine Expression von stabil mit den nAChR-Untereinheiten a6 und b4 transfizierten HEK-293/a1-Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat-Transfektionslösung und anschließend bei 30°C zu einem verbesserten Transport der Rezeptoren zur Zellmembran und damit zum erfolgreichen Expression funktioneller a6b4 nAChR. Die Wirkung der Transfektionslösung kann durch die erhöhte Calciumkonzentration erklärt werden, da in Ganzzellableitungen eine potenzierende Wirkung von Calciumionen auf den a6b4 nAChR bewiesen wurde. Somit konnte erstmalig der humane a6b4 nAChR in einer Säugerzellinie stabil und funktionell exprimiert werden.Englisch:This thesis is a study of the functional expression of nAChR in HEK-293/a1-cells, namely the a7 nAChR and a6-containing nAChR, which are in general difficult to express ectopically. In particular problems did not occur at the level of cell transfection, receptor transcription or translation and receptor assembly, but rather at the level of receptor transport to the cell membrane which was defective.Although different conditions were tested, the functional expression of a7 nAChR at the cell membrane of HEK-293/a1-cells could not be achieved. Intracellular localisation also prevented the functional expression of homomeric a6 nAChR and heteromeric a6b2 and a6b3 nAChR in HEK-293/a1-cells. However, stable co-transfection of the a6 and b4 nAChR subunits into HEK-293/a1-cells and culturing them in the presence of calcium phosphate transfection solution and subsequently at 30°C resulted in a correct transport of the receptors to the cell membrane and a successful expression of functional a6b4 nAChR. An increase in total calcium ion concentration could explain the positive effect of additional transfection solution in the culture medium, since a potentiating effect of calcium ions on a6b4 nAChR function was demonstrated in electrophysiological whole cell measurements. In summary, these data report for the first time the stable and functional ectopic expression of human a6b4 nAChR in a mammalian cell line