Molecular cloning, heterologous expression and characterization of Strictosidine Glucosidase from Rauvolfia serpentina cell suspension cultures

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die enzymatische Deglucosylierung von Strictosidin in Zellsuspensionskulturen von Rauvolfia serpentina zu charakterisieren.Ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Strictosidin aus pflanzlicher Zellkulturen wurde entwickelt. Zwei somatische Hybridzellkulturen zwischen R. serpentina und Rhazya stricta wurden als potenzielle Quelle dieses Glucoalkaloides untersucht. Der Sekundärstoffwechsel der pflanzlichen Zellen wurde mit Methyljasmonat induziert und 15 Stoffe wurden identifiziert, u. a. das neue Indolalkaloid 3-Oxo-rhazinilam. Die Gehaltsänderung von 7 Indolalkaloiden nach Behandlung mit Methyljasmonat wurde untersucht.Deglucosylierung von Strictisidin bei in E. coli exprimierter Raucaffricin Glucosidase wurde detektiert.Die Strictosidin Glucosidase kodierende cDNA wurde aus R. serpentina Zellsuspensionskulturen cloniert und in E. coli exprimiert. Das Enzyme wurde mit Hilfe des Inteintages gereinigt und seine Eigenschaften wurden untersucht, u. a. optimale Temperatur und pH Wert und Substratspezifität.Die Produkte von der enzymatischen Strictosidinhydrolyse wurden als Cathenamin (unter normalen Bedingungen) und Sitsirikin und Isositsirikin (im Gegenwart von Reduktoren) identifiziert. Das neue Indolalkaloid 3-Isocorreantin A wurde nach der enzymatischen Deglucosylierung von Dolichantosid (Nß-Methylstrictosidin) gebildet.The aim of the present work was identification and characterization of enzyme(s) involved in strictosidine deglucosylation in Rauvolfia serpentina cell suspension cultures and a detailed investigation of the catalyzed reaction.A protocol was developed for isolation and purification of strictosidine from plant cell suspension cultures. Two somatic hybrid cell lines between R. serpentina and Rhazya stricta were studied as potential source of this glucoalkaloid. Treatment with methyl jasmonate was employed to induce the secondary metabolism of plant cells. In total 15 compounds were identified, including a novel indole alkaloid 3-oxorhazinilam. The changes in content of 7 indole alkaloids under methyl jasmonate treatment were determined.The ability of raucaffricine glucosidase to deglucosylate strictosidine was detected using pure heterologously expressed enzyme.The cDNA encoding strictosidine glucosidase was cloned from R. serpentina cell suspension cultures and heterologously expressed in E. coli. The enzyme was purified to homogeneity using intein tag system and its properties were determined, e.g. temperature and pH optima and substrate specificity.The products of strictosidine deglucosylation under normal and reductive conditions were identified as cathenamine and sitsirikine/isositsirikine, respectively. Enzymatic deglucosylation of dolichantoside (N?-methylstrictosidine) led to the formation of a novel indole alkaloid 3-iso-correantine A