DNA-Array-Technologie

Es wurde ein genomischer DNA-Array der Modellpflanze Arabidopsis thaliana mit einer 13.800 EST-Klone umfassenden cDNA-Bibliothek entwickelt und in der Genexpressionsanalyse der pflanzlichen Pathogenabwehr eingesetzt. Mittels PCR-Amplifikation sind 13.000 PCR-Produkte der cDNA-Fragmente hergestellt worden, mit denen 66 genomische Arabidopsis-Arrays auf Nylon und Polypropylen als Trägermaterial hergestellt werden konnten. Die Validierung mit Fluoreszenz- und Radiaktivhybridisierung sowie der Vergleich von drei Normalisierungsmethoden führte zu reproduzierbaren Ergebnissen bei hohem Korrelationskoeffizienten. Die etablierte DNA-Array-Technologie wurde zur Genexpressionsanalyse der pathogeninduzierten Abwehrmechanismen der Pflanze Arabidopsis thaliana in den ersten 24 Stunden nach Infektion mit dem avirulenten Bakterium Pseudomonas syringae pv. tomato eingesetzt. In einer Auswahl von 75 Genen der Stoffwechselwege Glycolyse, Citrat-Cyclus, Pentosephosphat-Cyclus und Glyoxylatmetabolismus konnte für 25 % der Gene, im Shikimat-, Tryptophan- und Phenylpropanoidsyntheseweg für 60 % der Gene eine erhöhte Transkriptionsrate nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit stimmen mit experimentellen Daten verschiedener unabhängiger Studien zur pflanzlichen Pathogenantwort überein. Darüberhinaus sind erstmals Transkriptionsprofile von bisher auf Transkriptionsebene nicht untersuchten Genen erstellt worden. Diese Ergebnisse bestätigen die transkriptionelle Aktivierung ganzer Stoffwechselwege und gewähren erstmals einen Einblick in die koordinierte differentielle Transkription ganzer Stoffwechselwege während der Pathogenabwehr.A genomic cDNA array of the model plant Arabidopsis thaliana was produced by PCR amplification of a cDNA clone library consisting of 13,800 EST clones and applied to the analysis of gene expression upon pathogen infection. 13,000 PCR amplified cDNA fragments were identified in order to produce 66 genomic cDNA arrays on nylon and polypropylen support. Validation with fluorescence and radioactive hybridisation and the comparison of three normalisation methods demonstrated reproducible results with a high correlation coefficient. The established DNA array technology was applied to the analysis of gene expression of pathogen induced defense mechanisms of the plant Arabidopsis thaliana during 24 hours after infection with the avirulent bacterium Pseudomonas syringae pv. tomato. A selection of 75 genes showed that 25 % of the genes of the metabolic pathways glycolysis, citrate cylce, pentose phosphate cycle und glyoxylate metabolism and 60 % of the genes of the shikimate, aromatic amino acid and phenylpropanoid biosynthesis were differentially upregulated. These results confirmed previously published data, explored new differentially expressed genes and demonstrate the transcriptional activation of whole pathways and allow an insight into the coordinated differential transcription of whole pathways upon pathogen defense