Investigations on (photo) reactions of cosmetic UV filters towards skin proteins

Although UV filters are important, widespread used cosmetic ingredients, their reaction potential towards skin proteins has hardly been studied so far. Therefore, the aim of the present thesis was to investigate the reactivity of widespread UV filter substances towards skin proteins using increasingly complex protein and skin model systems and different analytical techniques. At first, the development of a rapid high-performance thin-layer chromatographic (HPTLC) screening method on an amino phase as protein model provided an easy and rapid way to estimate the reactivity of the common UV filters benzophenone-3 (BP-3), hydroxymethoxybenzoyl sulfonic acid (HMBS), butyl methoxydibenzoylmethane (BM-DBM), 3-benzylidene camphor (3 BC), 4 methylbenzylidene camphor (4 BMC), octocrylene (OCR), ethylhexyl methoxycinnamate (EHMC), ethylhexyl salicylate (EHS), diethylhexyl butamido triazone (DEBT), ethylhexyl triazone (EHT), and octyldimethyl p-aminobenzoic acid (OD-PABA) towards amino groups under thermal and irradiation conditions. A direct comparison of the results of the screening with (photo) patch test data of the dermatological practice showed that especially those UV filters, which are known to be common triggers for (photo) allergic reactions, showed the highest tendency to bind to the amino phase. This indicates that the screening may be well suited to identify possible skin sensitizers as part of a multistage testing strategy. The observation that the reactivity of the different UV filters was influenced by both heat and UV irradiation was verified during the subsequent studies with butylamine and ethanolamine. The UV filters showed individual, time- and temperature-dependent reactivities towards the amines. Benzophenone imines, enamines, and amides were identified as typical reaction products by means of electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), Fourier transform infrared (FTIR), and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. BP-3, HMBS, the dibenzoylmethanes, OCR, and EHS showed by far the highest reactivity what was in good correlation with the previous screening, indicating a different contact-allergic potential of the UV filters. In contrast, the esters EHMC and EHT showed a significantly lower reactivity, and for the UV filters 3 BC, 4-MBC, and OD-PABA no conversion was observable at all. The formation of the reaction products had partly big influence on the respective UV filter spectra. In the case of BP-3, HMBS, and EHS, the conversions led to a strong bathochromic shift and hence to approved UVA protection. In contrary, in the case of DBM and BM-DBM and especially OCR, a breakage of the original molecule structures was observed, resulting in a significant decrease of the respective absorption strength. The same reaction tendencies could also be observed, when using Boc-protected lysine, the tetrapeptide Boc-Gly-Phe-Gly-Lys-OH (Boc-GFGK), and bovine serum albumin (BSA) as increasingly complex protein or skin models. OCR and BM-DBM confirmed to be most reactive towards the lysine side chains of the mentioned model systems, followed by DBM > BP 3 > EHS > EHMC > EHT in decreasing order. To determine the covalent binding of the UV filters to the protein BSA, beside the extraction of the unbound UV filters, the increase of the molar mass of the formed BSA-adducts was additionally exemplarily determined for EHMC and DBM by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOFMS). Both methods gave comparable results. Binding to BSA did not affect the UV absorption properties of BM-DBM, EHMC, and EHT, but led to a bathochromic shift in the cases of BP-3 and EHS. For OCR, a strong hypsochromic shift and a nearly complete loss of UVA+B protection was observable. To better reflect the usual application conditions, a thin gelatine layer was chosen as further skin model. The UV filter amounts applied were adapted according to the existing ISO norm for the determination of the SPF. Afterwards, UV irradiation was performed. The binding amounts were determined both by extraction of the unbound UV filters and by isotope-ratio mass spectrometry (IRMS), where two synthetized, stable-isotope labelled UV filter analogues (EHC-d5 and DBM-d5) were used. In contrast to the esters EHMC and EHT, which showed comparatively small binding amounts, for the UV filters OCR, BP-3, EHS, and BM-DBM significant reaction tendencies towards gelatin were observed. Finally, various commercial sunscreens and personal care products with UV protection were applied on either prepared porcine skin or glass plates, followed by UV irradiation. Significant differences were observed for the amounts of UV filters extracted from glass and skin. The lower recoveries in the case of the skin indicated an additional reaction of the UV filters towards the skin samples. BP-3 showed the highest discrepancy between the recoveries from glass and skin after irradiation, followed by EHS > BM DBM > OCR > EHMC > EHT in decreasing order. The present dissertation showed that cosmetic UV filters were able to react with amino structures of different proteins under thermal and irradiation conditions. As the formation of protein adducts is seen as key event in the development of (photo) allergic reactions, the results indicate a specific skin sensitization potential of the UV filters. This is confirmed by the experience of dermatological practice. Since such reactions have partly strong influence on the respective UV filter spectra, the existing in vitro methods using PMMA or quartz glass as substrates have to be questioned, since those methods cannot capture such skin-typical reactions.Obwohl UV-Filter vielfach verwendete kosmetische Inhaltsstoffe sind, wurde ihr Reaktionsvermögen gegenüber Hautproteinen bisher kaum untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Reaktivität weit verbreiteter UV-Filters gegenüber Hautproteinen zu untersuchen. Hierfür wurden unterschiedliche, komplexer werdende Protein- und Hautmodelle sowie unterschiedliche analytische Methoden herangezogen. Im ersten Schritt wurde eine schnelle hochleistungsdünnschichtchromatographische (HPTLC) Screening-Methode auf Basis einer Aminophase als Proteinmodell entwickelt. Durch die Bestimmung des Bindungsvermögens der UV-Filtersubstanzen Benzophenon-3 (BP-3), 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure (HMBS), Octocrilen (OCR), Butylmethoxydibenzoylmethan (BM-DBM), Dibenzoylmethan (DBM), Ethylhexylsalicylsäure (EHS), 3-Benzylidencampher (3-BC), 4-Methylbenzylidencampher (4-MBC), Ethylhexylmethoxyzimtsäure (EHMC), Diethylhexylbutamidotriazon (DEBT), Ethylhexyltriazon (EHT) und Octyldimethyl-p-aminobenzoesäure (OD PABA) an die Aminoschicht konnte die generelle Reaktivität der UV-Filter gegenüber Proteinstrukturen unter dem Einfluss von Wärme und UV-Bestrahlung bestimmt werden. Ein direkter Vergleich der Ergebnisse des Screenings mit (Photo)patchtest-Daten aus der dermatologischen Praxis zeigte, dass insbesondere die UV-Filter, die als typische Auslöser (photo)allergischer Reaktionen gelten, auch auf der Aminophase die größte Bindungstendenz zeigten. Dies legt die Vermutung nahe, dass das entwickelte Screening als Teil einer Testbatterie dazu beitragen kann, mögliche sensibilisierende Stoffe zu identifizieren. Die Reaktivität der untersuchten UV-Filter gegenüber Aminstrukturen wurde anschließend durch in vitro Untersuchungen mit Butylamin und Ethanolamin überprüft. Die UV-Filter zeigten eine zeit- und temperaturabhängige Reaktivität gegenüber den beiden Aminen. Mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS), Infrarotspektroskopie (IR) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) konnten Benzophenonimine, Enamine und Amide als typische Reaktionsprodukte identifiziert werden. BP-3, HMBS, DBM, BM DBM, OCR und EHS zeigten bei weitem die größte Reaktivität. EHMC und EHT hingegen zeigten eine deutlich geringere Reaktivität und für 3-BC, 4-MBC und OD PABA konnte keinerlei Umsatz detektiert werden. Die Bildung der unterschiedlichen Reaktionsprodukte führte teils zu starken Veränderungen im Absorptionsspektrum der UV-Filter. Für BP-3, HMBS und EHS wurde eine bathochrome Verschiebung der Spektren und damit eine erhöhte UVA-Schutzwirkung festgestellt. Im Gegensatz dazu war im Falle von DBM, BM-DBM und OCR ein Bruch der ursprünglichen Struktur feststellbar, was zu einem deutlichen Verlust der Absorptionsstärke führte. Ähnliche Reaktionstendenzen der einzelnen UV-Filter waren auch für die komplexer werdenden Reaktionspartner Boc-Lysin, das Tetrapeptid Boc-Gly-Phe-Gly-Lys-OH (Boc-GFGK) und Rinderserumalbumin (BSA) feststellbar. OCR und BM-DBM zeigten die größte Reaktivität, gefolgt von den UV-Filtern DBM > BP 3 > EHS > EHMC > EHT in abnehmender Reihenfolge. Um eine Bindung der UV-Filter an BSA festzustellen, wurde zusätzlich zur Extraktion der ungebundenen UV-Filter die Veränderung der molaren Masse des Proteins beispielhaft für EHMC und DBM mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation (MALDI-TOFMS) bestimmt. Beide Methoden zeigten vergleichbare Ergebnisse. Im Falle von BM DBM, EHMC und EHT zeigten sich durch die Bindung an BSA keine deutlichen Unterschiede in den UV-Spektren, bei EHS und BP-3 war hingegen eine bathochrome Verschiebung zu beobachten. Für OCR zeigte sich eine hypsochromen Verschiebung und ein fast vollständiger Verlust der UVB-Schutzwirkung. Um die realen Anwendungsbedingungen noch besser abzubilden, wurde eine dünne Gelatineschicht als Hautmodell verwendet und nach Auftragung der UV-Filter bestrahlt. Die Bindungsmenge der UV Filter wurde mittels Extraktion der ungebundenen Substanzen sowie Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (IRMS) unter Verwendung der synthetisierten, Deuterium-markierten UV Filteranaloga EHC-d5 und DBM-d5 bestimmt. Im Gegensatz zu den Estern EHMC und EHT, für die eher geringe Bindungsmengen festgestellt wurden, zeigten OCR, BP-3, EHS und BM-DBM eine deutliche Bindungstendenz gegenüber der Gelatineschicht. Abschließend wurden unterschiedliche handelsübliche Sonnenschutzprodukte auf präparierte Schweinehaut sowie Glasplättchen aufgetragen und bestrahlt. Bei der sich anschließenden Extraktion der UV-Filter wurden signifikante Unterschiede zwischen den jeweils ermittelten UV-Filtergehalten festgestellt. Die geringeren Wiederfindungen im Falle der Schweinehaut ließen auf eine zusätzliche Reaktion der UV-Filter auf der Haut schließen. Für BP-3 war der deutlichste Unterschied zwischen Glas und Haut feststellbar, gefolgt von EHS > BM-DBM > OCR > EHMC > EHT in absteigender Reihenfolge. Mit der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass kosmetische UV-Filter unter dem Einfluss von Wärme und UV-Licht in der Lage sind, mit Aminostrukturen unterschiedlicher Proteine zu reagieren. Da die Bildung von Proteinaddukten als entscheidender Schritt bei der Ausbildung von (Photo)allergien gilt, lassen die Ergebnisse auf ein Sensibilisierungspotential der Inhaltsstoffe schließen. Dies wird durch die Erfahrungen aus der dermatologischen Praxis bestätigt. Da sich die Reaktionen teils stark auf die UV-Spektren der jeweiligen UV-Filter und deren Schutzleistung auswirken, sollten die existierenden in vitro Methoden zur Bestimmung der Wirksamkeit von Sonnenschutzprodukten kritisch hinterfragt werden, da beim Einsatz inerter Substratmaterialien wie PMMA oder Quarzglas der Einfluss hautspezifischer Reaktionen nicht berücksichtigt wird