Transepithelial activation of human leucocytes by probiotic and commensal bacteria

Hintergrund: Die Mucosa des Gastroinstinaltrakts spielt eine entscheidende Rolle bei der Unterscheidung von pathogenen und nichtpathogenen Bakterien und ist an der Vermittlung der systemischen Immunantwort beteiligt. In dieser Arbeit wurde die Wirkung probiotischer, kommensaler, pathogener und lebensmitteloriginärer Bakterien und deren Oberflächenbestandteilen auf kokultivierte Enterozyten und Lymphozyten untersucht. Dabei war insbesondere die immunologische Reaktion, deren Ursachen, sowie die Reihenfolge der Aktivierung der Epithelzellen und darunter lokalisierten Leukozyten von Bedeutung. Material und Methoden: PBMCs (Peripheral blood mononuclear cells) wurden transepithelial in CaCo-2-Zell/PBMC Kokulturen und direkt mit kommensalen, probiotischen und enteropathogenen Bakterien sowie Zellwandbestandteilen von gram-negativen und gram-positiven Bakterien stimuliert. Die Expression der inflammatorischen Zytokine TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10 und IFN-γ wurde mittels enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) bestimmt. Die Messung des Quotienten aus IL-8/18S mRNA erfolgte mit Hilfe einer quantitativen reversen Transkriptions PCR (qRT-PCR). Das transepithelial permeierte Endotoxin wurde mit dem Limulus-Amobozyte-Test (LAL-Test) gemessen und die Integrität der CaCo-2-Zellmonolayer wurde mit Fluorescein-Dextran und der Messung des transepithelialen Wiederstands (TEER) bestimmt. Ergebnisse: Gram-positive probiotische Bakterien führen nicht zu einer signifikanten Aktivierung immunkompetenter Zellen, während der Zusatz des gram-negativen, probiotischen E. coli Nissle, eine stärkere Ausschüttung von TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10 und IFN-γ zur Folge hat als der des enteropathogenen E. coli EPEC. Die Klassifizierung der Bakterien als ?probiotisch? war nicht mit ihrer Fähigkeit assoziiert, die Bildung inflammatorischer Zytokine zu induzieren. Permeabiltätsunterschiede waren gleichfalls nicht prinzipiell mit einer erhöhten Aktivierung basolateraler Leukozyten assoziiert. So war sowohl bei direkter Stimulation als auch bei transepithelialer Stimulation keine Aktivierung durch Lipoteichonsäure (LTA) von E. faecalis messbar, während der Zusatz von Endotoxinen in Abhängigkeit von ihrem strukturellen Aufbau eine geringe (Bacteroides sp.) bis extrem starke (E. coli K12, E. coli Nissle, S. Typhimurium) Aktivierung immunkompetenter Zellen zur Folge hatten. Eine basolaterale Hemmung der Aktivität des LPS durch Polymyxin B und Colistin konnte die durch LPS von E. coli K12 induzierte Aktivierung fast vollständig inhibieren. Außerdem wurde durch direkte Stimulation mit der entsprechenden Menge des im Kokulturmodel permeierenden Endotoxins eine vergleichbare Ausschüttung inflammatorischer Zytokine wie bei transepithelialer Stimulation bewirkt. Eine Hemmung der durch E. coli K12 bzw. LPS von E. coli K12 hervorgerufenen Aktivierung immunkompetenter Zellen durch die probiotischen Bakterien Lb. rhamnosus und B. bifidum sowie den Kommensalen B. vulgatus konnte nicht gemessen werden. Bei Kostimulation mit den Endotoxinen von B. vulgatus und B. vulgatus MPK war mit zunehmender Konzentration des Endotoxins ein Trend zu einer Hemmung der E. coli K12-LPS-induzierten Zytokinausschüttung messbar. Schlussfolgerung: Diese Ergebnisse belegen, dass die Wirkung von probiotischen Bakterien nicht zwingend mit einer Aktivierung immunkompetenter Zellen in der Mucosa assoziiert ist. Die Fähigkeit zu stimulieren hängt vorangig von der Gegenwart von Endotoxin ab, wobei die Endotoxinstruktur ausschlaggebend für das jeweilige Stimulationspotential ist. Die Aktivierung von kokultivierten Enterozyten und Leukozyten erfolgt nicht über eine mittelbare Stimulation der Leukozyten via Enterozyten sondern primär über die Aktivierung basolateraler Lymphozyten durch permeierendes Endotoxin. Die Permeabilität der Epithelzellschicht ist nur dann entscheidend für den Grad der Aktivierung, sofern die permeierenden Endotoxine aufgrund ihrer strukturellen Gegebenheiten stimulierend wirksam sind.Background: The intestinal mucosa plays an important role in the discrimination of immune response between pathogenic and non-pathogenic bacteria as well as in mediating the systemic immunity. To adress the question whether probiotic, commensal, pathogenic germs and bacteria of food origin as well as their membrane components modify the immune response of the intestinal mucosa, we co-cultivated enterocyte-like CaCo-2 cells with human blood leucocytes in transwell cultures. Of further interest was the sequence of enteroxyte-leukocyte activation. Methods: PBMC (Peripheral blood mononuclear cells) were stimulated transepithelially in CaCo-2/PBMC co-cultures and directly challenged with probiotic, commensal, enteropathogenic and food-originating bacteria as well as with membrane components of grampositive and gramnegative bacteria. The expression of inflammatory cytokines (TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10 and IFN-γ) was studied by enzyme linked immunosorbant assay (ELISA). The ratio of IL-8/18S mRNA was detected using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT PCR). The permeation of endotoxin was quantified via Limulus amobocyte (LAL) assay and the integrity of the CaC-2 cell monolayer was detected via fluorescein-dextran and transepithelial electric resistance (TEER). Results: Grampositive bacteria did not activate immunocompetent cells in leukocyte-enterocyte co-cultures whereas a stimulation with the gramnegative probiotic E. coli Nissle resulted in higher expressions of TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10 and IFN-γ than stimulation with the enteropathogenic E. coli (EPEC). The feature ?probiotic? results not necessarily in an enhanced production of inflammatory cytokines. Differences in epithelial permeability were not necessarily associated with an enhanced activation of immunocompetent cells. There was no activation of immunocompetent cells after direct or transepithelial stimulation with lipoteichoic acid (LTA) of E. faecalis. In contrast, endotoxin depending on its structure was a very potent (E. coli K12, E. coli Nissle, S. Typhimurium) or a moderately potent (B. vulgatus, B. vulgatus MPK) inducer of an inflammatory cytokine response. A neutralisation of endotoxin permeating into the basolateral compartment with Polymyxin B and Colisin resulted in a nearly total inhibition of inflammatory response. Furthermore, directly stimulated PBMC with comparable amounts of the permeating endotoxin in CaCo-2/PBMC co-cultures showed the same activation status as transepithelially stimulated cells. The probiotic, nonstimulating bacteria (Lb. rhamnosus GG, B. vulgatus, B. bifidum) were not able to reduce the E. coli K12 induced TNF-α, IL-8, IL-6, IL-10 and IFN-γ production. A co-stimulation of LPS from E. coli K12 (1 µg/ml) with non-stimulating endotoxins (B. vulgatus and B. vulgatus MPK) 100 µg/ml tended to reduce cytokine expression. Conclusion: These results show that the attribute ?probiotic?does not result in an obligatory activation of immunocompetent cells. The ability to stimulate immunocompetent cells is preferentially dependent on the presence of endotoxin, regarding the structure which is responsible for the stimulating capacity and is not mediated by enterocytes in first line. Activation of the basolaterally located lymphocytes occurs via permeating endotoxin. The permeability of the intestinal epithelial layer is only relevant when permeating endotoxin is able to stimulate immunocompetent cells to due its structural features