Estandarización del modelo angiogénico de tapón de Matrigel en ratón y evaluación del efecto de calreticulina de Trypanosoma cruzi

Memoria para optar al Título Profesional de Médico VeterinarioLa angiogénesis es la generación de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes. Fisiológicamente, se produce sólo en casos excepcionales (inflamación crónica, ciclo menstrual, cicatrización, etc.), y es un mecanismo fundamental para el crecimiento de un tumor, desde los 2 mm3. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. CRT humana (HuCRT) y su dominio N- terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis, inhibiendo así la proliferación de células endoteliales. Anteriormente, en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), se ha descrito que CRT de Trypanosoma cruzi (TcCRT) es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo (CAM). Estas propiedades también son expresadas por TcCRT y su dominio N-terminal, en ensayos ex vivo e in vitro, en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies de mamíferos, Rattus rattus y Homo sapiens sapiens. Este efecto se correlaciona, en experimentos in vitro, con la inhibición de la morfogénesis capilar, la proliferación y la migración de las células endoteliales y con la internalización de TcCRT por estas células, también descrito en el LIAM. El objetivo general de este estudio fue validar los resultados antiangiogénicos de TcCRT obtenidos in vivo en aves, así como los generados in vitro y ex vivo, con varias especies de mamíferos, usando ahora un ensayo in vivo en un modelo mamífero. Esto se basa en la posibilidad de que las moléculas que regulan la angiogénesis pueden actuar de forma diferente en diferentes especies. Matrigel es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Entre los ensayos in vivo descritos para medir la angiogénesis, está el ensayo de tapón de Matrigel, que se utilizó en esta investigación, que se basa en la siguiente hipótesis: Dadas las propiedades antiangiogénicas que TcCRT expresa en una variedad de ensayos in vitro, ex vivo, en células mamíferas y, también in vivo en aves, entonces, TcCRT inhibirá la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en mamíferos (Mus musculus). Los objetivos específicos para satisfacer esta hipótesis, fueron: 1. Estandarizar el ensayo de tapón de Matrigel in vivo para medir angiogénesis, 2. Estandarizar la concentración de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) por tapón de Matrigel, 3. Determinar la presencia de TcCRT recombinante (rTcCRT) y HuCRT recombinante (rHuCRT) en extracto proteico de tapones de Matrigel, y 4. Cuantificar el efecto de rTcCRT y rHuCRT sobre la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en ratón. 500μl de Matrigel, que contiene 300ng de bFGF (para promover la infiltración de células endoteliales), fueron inoculados por vía subcutánea a ratones C57BL/6. Siete días más tarde, fue posible diseccionar y analizar los tapones, tanto inmunológica e histológicamente. Además, los anticuerpos mono y policlonales, anti-TcCRT y anti- HuCRT reconocieron las proteínas recombinantes en extracto proteico de tapón de Matrigel. rHuCRT y rTcCRT inhibieron la proliferación de células endoteliales promovido por bFGF en los tapones de Matrigel. En síntesis, se demostró que TcCRT inhibe la migración de células endoteliales a una matriz fisiológica semisólida, tal como el Matrigel ubicado subcutáneamente en ratones. Dado que la migración de células endoteliales es un pre-requisito para la morfogénesis capilar, es muy probable que este ensayo se correlacione con la capacidad de inhibición que la molécula parasitaria ejerce in vivo sobre el crecimiento tumoral. Este es el primer estudio que define un efecto antiangiogénico para la calreticulina parasitaria, in vivo en mamíferos. Aun cuando, más indirectamente, este efecto podría correlacionarse con las propiedades antitumorales de T. cruzi, reportadas por otros laboratorios, y recientemente confirmadas en el LIA