Identificación y clonación de nuevas celulasas para la producción de bioetanol de segunda generación

Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en BiotecnologíaDebido a la alta demanda de combustibles y la creciente alza en el precio del petróleo es primordial buscar nuevas alternativas energéticas para satisfacer las necesidades de la población. Dentro de este escenario, considerando la abundancia de residuos lignocelulósicos forestales y agroindustriales en nuestro país, la posibilidad de producir bioetanol a partir de éstos parece ser una alternativa bastante atractiva en los aspectos estratégicos y ambientales. La hidrólisis de la celulosa es una de las etapas que tiene mayores posibilidades de ser optimizada con el fin de reducir los costos de producción del bioetanol de segunda generación. Ésta se basa en la utilización de una mezcla de celulasas que causan la depolimerización de la celulosa con el fin de generar azúcares simples (glucosa). Considerando lo anterior, el presente Trabajo de Memoria de Título, tuvo como objetivo la identificación de secuencias pertenecientes a nuevas endoglucanasas que puedan ser utilizadas en el proceso de hidrólisis de celulosa. La estrategia utilizada se dividió en tres etapas principales: (i) la realización de un screening de actividad endoglucanasa sobre un conjunto de hongos de pudrición blanca, para identificar cuales poseían enzimas con esta actividad; (ii) la amplificación por PCR desde DNA genómico y cDNA de fragmentos pertenecientes a secuencias que codifican para estas enzimas, utilizando partidores degenerados diseñados a partir de regiones de homología de endoglucanasas de hongos; y (iii) la amplificación de regiones aledañas a las secuencias obtenidas utilizando la estrategia RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends). Mediante la utilización de esta metodología, fue posible obtener fragmentos de secuencias de genes de glicosil hidrolasas, los cuales fueron clonados y analizados in sílico, obteniéndose los siguientes resultados: a partir del cDNA se obtuvieron fragmentos de cuatro endoglucanasas y una exoglucanasa. Una de las secuencias de endoglucanasa pertenece a la familia 5 y procede del hongo Polystictus versicolor; la segunda pertenece a la familia 7 y procede de Fusarium oxysporum; una tercera pertenece a la familia 61 y procede del hongo Ganoderma applanatum, mientras que la cuarta pertenece a la familia 61 y procede del hongo Fusarium oxysporum. Las secuencias se compararon con secuencias de endoglucanasas presentes en las bases de datos, encontrándose que poseen un porcentaje de identidad a nivel de secuencia aminoacídica de 93, 100, 58 y 60 % con respecto al mejor alineamiento observado, respectivamente. La secuencia de exoglucanasa proviene del hongo Polystictus versicolor y se clasifica dentro de la familia 7, con un 80% de identidad aminoacídica con respecto al mejor alineamiento observado. De todas las endoglucanasas identificadas en este trabajo, sólo la proveniente del hongo Fusarium oxysporum se encontraba previamente descrita. A partir de DNA genómico, no fue posible obtener fragmentos con utilidad para el proceso de hidrólisis de celulosa. En conclusión, la estrategia utilizada fue exitosa, siendo posible obtener fragmentos de secuencia de tres endoglucanasas de hongos no descritas, que pueden ser potencialmente útiles en el proceso de hidrólisis de celulosa para la producción de bioetanol de segunda generación