Caracterización de la interacción de Rrn7 con los factores transcripcionales TFiiB y TBP en promotores que contienen la caja HomoID en Schizosaccharomyces pombe

Memoria para optar el título de BioquímicoLa transcripción del DNA, primera etapa de la expresión génica, corresponde a la conversión de un DNA molde a RNA por acción enzimática de la RNA polimerasa (RNAP). En las células de los organismos eucariontes existen tres clases de RNA polimerasas nucleares (RNAP I, II y III). Cada clase de RNAP reconoce promotores específicos mediante la formación de complejos de preiniciación (Pre-initiation Complex o PIC) entre la RNAP y el uso factores de transcripción generales (General Transcription Factors o GTFs), siendo estos últimos los que dan especificidad a cada PIC. Los promotores son secuencias de DNA, normalmente ubicadas río arriba del inicio de la transcripción (Transcription Start Site o TSS), relativamente conservadas en el genoma, que poseen todos los elementos en cis necesarios para el inicio y la regulación de la transcripción de un gen. Los promotores de la RNAP II son los más estudiados y se clasifican en los que poseen caja TATA y en los que no, llamados TATA-Less. Entre los factores de transcripción que se unen a estos promotores están TFIIB, TFIID, TFIIA, entre otros. La caja HomolD es un elemento del promotor mínimo que se encuentra en un promotor de tipo TATA-less de secuencia consenso CAGTCACA, descubierto en genes de proteínas ribosomales de Schizosaccharomyces pombe, y que es capaz de reclutar la RNAP II e iniciar la transcripción. Estudios recientes indican que para iniciar la transcripción desde estos promotores se necesitan los siguientes GTFs: TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIH y TFIIE. Además, se ha propuesto que el factor Rrn7 (antes conocido como miembro de la maquinaria de la RNAP I) podría interaccionar con algunos de estos GTFs, como por ejemplo TFIIB y/o TBP (miembro del complejo TFIID), lo que le conferiría a Rrn7 la facultad de unirse a la caja HomolD y dirigir la transcripción. Sin embargo, aún se desconoce cuáles de estos factores junto a Rrn7 conforman el PIC, que se ensambla sobre la caja HomolD. En este trabajo se estudió la participación de los factores TFIIB y TBP, como miembros candidatos del complejo de pre-iniciación formado sobre la caja HomolD. Mediante ensayos en geles de retardo o EMSA y ensayos de inmunoprecipitación de cromatina se analizaron las interacciones DNA-proteína y proteína-proteína. Para realizar los ensayos de EMSA fue necesario expresar y purificar la proteína Rrn7 recombinante utilizando una etiqueta de histidina, la que se utilizó junto a TBP y TFIIB. Además, se purificaron anticuerpos policlonales contra ambos factores, y fueron usados en ensayos de EMSA a modo de control. Los resultados de los EMSA muestran una intensificación de la banda representativa al complejo Rrn7-caja HomolD al agregar cada factor a la reacción (TFIIB o TBP). Los ensayos de ChIP se realizaron en una cepa silvestre de S. pombe utilizando los mismos anticuerpos purificados contra los factores TBP y TFIIB. El DNA obtenido, fue sometido a amplificación mediante PCR utilizando partidores específicos para la caja HomolD. Además se realizaron dos controles, uno utilizando partidores que amplificaron parte del promotor y del primer exón del gen nmt1 para la caja TATA como control positivo, y otros para una región del gen de actina (act1) como control negativo. Se observó amplificación del DNA representativo a la caja HomolD, al precipitar cada factor, reflejando la presencia de éstos en la región promotora. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran in vitro (EMSA) un efecto potenciador de TBP y TFIIB sobre la formación del complejo Rrn7-caja HomolD, lo que es complementario a la presencia mostrada in vivo (ChIP) de estos factores en el promotor. De estos experimentos se concluye la participación de ambos factores en la formación del complejo de pre-iniciación sobre la caja HomolD. Además los resultados de EMSA indicaron que TFIIB posee un efecto potenciador mayor que TBP a una determinada concentración. Por otro lado, en ensayos EMSA ambos factores produjeron un desplazamiento o retardo de la banda del complejo Rrn7-HomoID, pero el desplazamiento provocado por TBP fue más intenso y estable, a diferencia del de TFIIB que fue solo temporal. Estos resultados sugieren que los roles que cumplen los factores TFIIB y TBP en el PIC en la caja HomolD, son el de un factor reclutador de Rrn7 al promotor y el de un factor potenciador de la interacción proteína-DNA, respectivamenteDNA transcription, the first stage of gene expression, is defined as the conversion of a template DNA to RNA by the enzymatic action of the RNA polymerase (RNAP). In the eukaryotic cells there are three classes of nuclear polymerases (RNAP I, II and III). Each class of RNAP recognizes specific promoters through the formation of pre initiation complexes (PIC) between the polymerase and general transcription factors (GTF). The latter provide the specificity to each PIC. These promoters are relatively conserved DNA sequences that usually are located upstream from the transcriptional start site (TSS), and have all the cis elements needed for the start and regulation of the transcription of a gene. RNAP II promoters are the most studied ones, and are categorized as those that have a TATA box or those that lack a TATA box, called TATA-less promoters. The factors that bind to these promoters are TFIIB, TFIIA and TFIID, among others. The HomolD box is a core promoter element (CPE) that is found in a TATAless type promoter, whose consensus sequence is CAGTCACA. This CPE was discovered in ribosomal protein genes of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and recruits RNAP II and starts transcription. Recent studies have shown that to start transcription from these RNAP II promoters the GTFs: TFIID, TFIIB, TFIIF, TFIIH and TFIIE are needed. Furthermore, it has been proposed that the Rrn7 factor (formerly known as a member of the RNAP I machinery) interacts with some of these GTFs, for instance with TFIIB and/or TBP (member of the TFIID complex), which could confer Rrn7 the ability to bind the HomolD box and promote transcription. However, it is still unknown which of these factors in addition to Rrn7 conform the PIC that assembles over the HomolD box. In this work the participation of the factors TBP and TFIIB, as candidate members of the PIC formed over the HomolD box, was studied. Using Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) and Chromatin Immunoprecipitation assays (ChIP), DNA-protein and protein-protein interactions were analyzed. To carry out the EMSA studies, it was necessary to express and purify the recombinant Rrn7 protein using a 6xHis tag, which was then used with the factors TBP and TFIIB, also recombinant from S. pombe. Additionally, polyclonal antibodies for both factors were purified and used in EMSA experiments as a control. The EMSA results showed an intensification of the band representative of the complex when each factor was added to the reaction (TBP or TFIIB). ChIP assays were performed in a wild type S. pombe strain, using the same antibodies purified for TFIIB and TBP. The DNA obtained was amplified with PCR using specific primers for the HomolD box. Two controls were carried out, one using primers that amplified part of the promoter and the first exon of the nmt1 gene for the TATA box as a positive control. The other control used primers for a region of the actin gene (act1) as a negative control. When each factor was precipitated, an amplification of the HomolD box sequence, revealing the presence of both factors at the promoter region. Results obtained in this work show in vitro (EMSA) an enhancer effect of TBP and TFIIB on the formation of the Rrn7-HomolD box complex, which is complementary to the presence shown in vivo (ChIP) of these factors in the promoter. From these experiments it is concluded that both factors participate in the formation of the PIC over the HomolD box. Furthermore, the EMSA results indicate that TFIIB has a greater enhancer effect than TBP. On the other side, EMSA assays of both factors produced a shift of the complex Rrn7-HomolD band, but the one produced by TBP was more intense and stable, in comparison with the complex produced by TFIIB, which was temporal and less intense. These results suggest that TFIIB recruits Rrn7 to the PIC and that TBP enhances the interaction between protein and DNA of the PIC at the HomolD bo