Efecto de la exposición a estradiol sobre la función reproductiva en la rata: cambios tempranos en la expresión génica y participación del factor de crecimiento nervioso

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en FarmacologíaLa función ovárica es controlada por un eje endocrino y una regulación nerviosa paralela. La administración de valerato de estradiol (EV) a ratas produce una condición morfológica de ovario poliquístico (PCO) que está acompañada por un tono adrenérgico aumentado. Esta condición está precedida por el aumento del factor de crecimiento nervioso (NGFB) y su receptor, NGFR. La relación causal entre la actividad nerviosa y el desarrollo de PCO se demostró, ya que la disección del nervio ovárico superior (NOS) o la administración de anticuerpos contra NGFB producen la reversión de la condición de ovario poliquístico generada por EV en ratas adultas. Esta reversión ocurre a nivel de la dinámica folicular, ciclicidad estral y tono adrenérgico. Además de estos resultados evidencias preeliminares muestran que la condición de PCO tiende a revertir en forma espontánea en estas ratas, sin embargo ésta no ocurre en la misma magnitud en ratas tratadas en la edad neonatal con EV, manteniéndose éstas acíclicas, sugiriendo una ventana en la cual estradiol produce efectos irreversibles en el control nervioso de la función ovárica. Nuestro objetivo fue determinar la ventana de mayor sensibilidad al tratamiento con EV y los cambios tempranos en NGFB/NGFR/TrkA, que programan la condición de ovario poliquístico en la rata de forma irreversible. Administramos EV a distintas edades (1, 7, 14, 21 y 30 días postnatal) y controlamos los ciclos estrales hasta los 6 meses de edad. En ese momento evaluamos la morfología ovárica y norepinefrina (NE) por HPLC. Encontramos que las ratas tratadas a los 1, 7 y 14 días de edad se mantenían acíclicas durante todo el periodo estudiado, lo que se condecía con un pobre desarrollo folicular, anovulación y presencia de quistes foliculares ováricos. En cambio las ratas que fueron tratadas a los 21 y 30 días de edad con EV recuperaron su ciclicidad estral, la capacidad ovulatoria, mostraban un patrón de desarrollo folicular similar al control. En conclusión la ventana de sensibilidad al efecto deletéreo permanente producido por EV corresponde a la etapa neonatalinfantil en la rata. Además nos propusimos buscar el mecanismo por el cual estradiol genera estos efectos. Para esto se realizó la técnica Microarray para evidenciar los genes relacionados a neurotrofinas y receptores que cambian luego de la administración neonatal de EV. Encontramos que varios genes relacionados con proliferación celular, apoptosis, diferenciación y cambios epigenéticos inducidos por EV eran regulados a la baja. Según esto realizamos inmunohistoquímica y TUNEL para evidenciar que células están muriendo o proliferando y cuales están sujetas a cambios epigenéticos en el ovario neonatal de rata. Aparentemente, existe un desbalance en la conducta proliferativa y diferenciación de células implicadas en el ensamblaje folicular, lo que repercute en un menor número de folículos primarios en las ratas inyectadas con la hormona. Por último para verificar si el aumento de NGFB fue el responsable de los cambios permanentes producidos en el desarrollo folicular, administramos un anticuerpo policlonal contra NGFB durante los 3 primeros días de vida en ratas tratadas el día 1 de edad con EV. Al analizar el ovario a los 60 días de vida, además de una baja concentración de NA y NGFB elevado, existe un aumento de folículos antrales grandes y una acumulación de estructuras foliculares prequísticas y quísticas, sugiriendo que la presencia de niveles aumentados de NGFB durante la vida adulta facilita la conversión de estructuras preovulatorias en folículos quísticos. Además la ausencia de ovulación indica fuertemente que probablemente existen mecanismos dependientes de catecolaminas, como la ovulación, y otros mecanismos que dependen de NGFB, como el desarrollo folicular, que en forma fina y coordinada regulan la función ovárica.Ovarian function is under dual gonadotropic and neural control driven by gonadotropins and sympathetic nerves respectively. Estradiol Valerate (EV) single exposure to neonatal or adults rats develops a polycystic ovarian condition (PCO), which is preceded by an increased adrenergic tone and an increased concentration of Nerve Growth Factor (NGFB) and its low affinity receptor NGFR. A causal relationship between the nerve activity and PCO was demonstrated, since either the Superior Ovarian Nerve resection (SONX) or the blockade of NGFB with an antibody against the peptide reversed the polycystic condition in adult EV-treated rats. Previous work of our group have shown that the reversion occurs spontaneously in rats treated at different ages with the hormone, but it does not occur in rats are exposed to EV in the early life. Thus it is suggested that exists a developmental window in which estradiol produces irreversible damages in the reproductive system. Our aim was to determine this window of sensitivity to the deleterious effects of estradiol and the mechanism underlying this effect. We administered a single EV dose (10 mg/Kg) at different ages and the estrual cyclic activity was controlled until 6 month of life. At this age we analyzed the ovarian morphology and the noradrenaline (NA) ovarian concentration. We find that EV-treated rats at 1, 7 and 14 days old were acyclic during the whole period studied, and in addition they had a poor follicular development, anovulation and follicular cyst formation. In contrast, rats that were treated at days 21 and 30 of life recovered the estrual cyclic activity, the normal follicular development and the ovulatory capacity. In conclusion, the neonatal-infant period of life is the most sensitive period to the permanent damage produced by estradiol in the rat. Looking for the mechanism by which estradiol generates these effects, we performed a microarray to quantify the changes in the expression of neurotrophins, its receptors and related genes, 24h after estradiol exposure. Different changes in the expression of genes (particularly down-regulation) related to cell proliferation/differentiation and epigenetic regulations of gene expression were observed. We choose some genes specially affected and we did inmunohistochemistry against PCNA,Hystone H3 acetylated and TUNEL. Apparently there is an unbalance in the pattern of proliferation and differentiation in cells during the follicular assembly, a fact that has repercussion in the number of primary follicles. These results strongly suggest that rapid and early changes to the neurotrophin/receptors system, participates in the changes in follicular development found when rats were exposed neonatally to estradiol. Finally, and to verify if the primary increase in NGF was responsible for the permanent changes in follicular development, we administrated a policlonal antibody against NGFB during the first three days after birth to rats treated with EV the first day of age. The analysis of follicular development demonstrated that , in addition to a 90% decrease in NE concentration in the ovary and a increase in endogenous NGFB concentration, adults rats presented a further accumulation in precysts and cysts and in the preovulatory follicles strongly suggesting that the presence of increased levels of NGF during adulthood facilitates the conversion of antral follicles to cysts and because these rats did not recovered the ovulatory performance, there are probably mechanisms dependent of the presence of catecholamines (eg. ovulation) and other mechanism such us follicular development depend of NGF, strongly suggesting that ovary function is the results of coordinated regulation in which both sympathetic nerves and NGFB participates.CONICYT; FONDECYT; MECESU