Local anesthetics as a new therapeutic approach in oral squamous cell carcinoma - an in vitro study

Tese de mestrado em Patologoia Experimental, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraOral squamous cell carcinoma (OSCC) represents the most frequent malignant neoplasia that affects the oral cavity, accounting for more than 90% of cases. The etiology of OSCC is multifactorial and involves intrinsic and extrinsic factors, namely tobacco and alcohol. Besides the new and advanced therapeutic strategies, patients with OSCC show poor survival rates. Local anesthetics are usually used to control pain in patients with head and neck tumors, but recent reports have been shown that also can inhibit cancer cell proliferation, invasion and migration. In this work, we proposed to evaluate the potential therapeutic efficacy of the local anesthetics, Lidocaine and Mepivacaine, in in situ and metastatic OSCC cell lines, alone and in combination with conventional treatment (Cisplatin, 5-Fluorouracil) and studied the underlying mechanisms, namely their role in cancer invasion and metastization. For these proposes, two OSCC cell lines were maintained in culture, the HSC-3 (metastatic) and BICR-10 (in situ) cells, in absence and in presence of different concentrations of Lidocaine or Mepivacaine in monotherapy (daily or single dose administration) or in association with conventional chemotherapeutic drugs (Cisplatin or 5-Fluorouracil). Cell viability was assessed by the rezasurin assay and cell death by optical microscopy (May-Grünwald-Giemsa staining) and flow cytometry using the Annexin V/Propidium Iodide double staining. The influence of these compounds in cell cycle (Propidium Iodide incorporation), mitochondrial membrane potential (JC-1 probe), caspases (Apostat kit), reactive oxygen species production (hydrogen peroxide and superoxide anion were evaluated by 2,7-Diclorofluorescein and Dihidroetidium, respectively) and in the level of the antioxidant defense reduced glutathione (using Mercury Orange) were performed by flow cytometry. Cell adhesion was evaluated by measure E-chaderin expression, by flow cytometry, and β1-Integrin and β-Catenin expression, by western blot. Cell migration evaluation was realized by measuring basal XVIII expression of matrix metalloproteinases 2 and 9 by flow cytometry, and their proteolytic activity by zymography assay, and, posteriorly, performing the wound healing assay. Results were statistically analyzed. Our study showed that local anesthetics in monotherapy and in combination with conventional chemotherapy inhibited cell proliferation and migration, and induced cell death mainly by later apoptosis/necrosis in both cell lines in a dose, time, administration schedule and cell type dependent manner, being the HSC-3 the most sensitive relatively to BICR-10. At 48 hours, the IC50 of both local anesthetics, in HSC-3 cells, was reached at 4.5 mM, while in BICR-10 cells the IC50 was reached with 5,5 mM of Lidocaine and 10 mM of Mepivacaine. These results may be related with the increased in caspases and superoxide anion levels and decreased mitochondrial membrane potential, suggesting the involvement of mitochondria in cell death. The high sensitivity of HSC-3 cells to local anesthetics may be related with the lowest reduced glutathione levels when compared to BICR-10 cells. The pre-G1 peak observed in cell cycle analysis with Lidocaine and Mepivacaine at IC50 doses confirms apoptosis. The association of both local anesthetics with chemotherapeutic drugs induced an anti-proliferative effect with blockade of cell cycle, predominantly in S phase. Cell adhesion was not affected significantly by local anesthetics, although we observed a tendency to increase E-cadherin expression levels. Local anesthetics and its association with Cisplatin and 5-Fluorouracil also inhibits cell migration as we observed a decrease in matrix metalloproteinases proteolytic activity (more prominent in metastatic cell line), and a gap in wound healing assay after treatment comparing with the non-treated condition after 24 hours of scratch. As conclusion, our in vitro results showed that Lidocaine and Mepivacaine alone or in combination with conventional chemotherapeutic treatment may constitute a new complementary therapeutic approach in OSCC, namely in metastatic cancer.O carcinoma espinho-celular é a neoplasia mais frequente da cavidade oral, representando mais de 90% dos casos. A etiologia do carcinoma espinho-celular da cavidade oral (CECCO) é multifatorial, envolvendo fatores intrínsecos e extrínsecos, nomeadamente o consumo de tabaco e álcool. Apesar das novas estratégias terapêuticas, os doentes com CECCO apresentam uma baixa sobrevivência. Os anestésicos locais são usados para controlo da dor em doentes com cancro da cabeça e pescoço. Estudos recentes mostram que estes também podem inibir a proliferação, invasão e migração de células neoplásicas. Neste trabalho, propusemo-nos avaliar a eficácia terapêutica dos anestésicos locais (Lidocaína e Mepivacaína) e seus mecanismos, em linhas celulares de CECCO in situ e metastático, quer em monoterapia, quer em combinação com quimioterápicos de uso convencional (Cisplatina e 5-Fluorouracilo). Para cumprir estes objetivos, foram mantidas em cultura duas linhas celulares de CECCO, HSC-3 (metastático) e BICR-10 (in situ), na ausência e presença de diferentes concentrações de Lidocaína e Mepivacaína em monoterapia (administração única e diária) e em associação com fármacos quimioterápicos convencionais (Cisplatina e 5-Fluorouracilo). A viabilidade celular foi avaliada pelo teste da resazurina e a morte celular por microscopia ótica (coloração de May-Grünwald-Giemsa) e por citometria de fluxo usando dupla marcação com Anexina V/Iodeto de Propídeo. A influência destes fármacos no ciclo celular (incorporação com Iodeto de Propídeo), no potencial de membrana mitocondrial (sonda JC-1), na expressão de caspases (Apostat kit), na produção de espécies reativas de oxigénio (peróxido de hidrogénio e anião superóxido, através das sondas 2,7-Diclorofluoresceína e Dihidroetideo, respetivamente) e na expressão de glutationa reduzida (pelo Alaranjado de Mercúrio) foi realizada por citometria de fluxo. A adesão celular foi avaliada pela medição da expressão de E-Caderina, por citometria de fluxo, e ainda da expressão das β1-Integrina e β-Catenina, por XXIII western blot. O estudo da migração celular foi realizado pela avaliação da expressão de metaloproteinases da matriz 2 e 9 por citometria de fluxo, e da sua atividade proteolítica por zimografia de gelatina. Posteriormente, foi ainda realizado o teste de scratch. Os resultados foram analisados estatisticamente. O nosso estudo mostrou que os anestésicos locais em monoterapia e em combinação com a terapêutica quimioterápica convencional inibiram a proliferação e migração celulares e induziram morte celular principalmente por apoptose tardia/necrose em ambas as linhas celulares estudadas de uma forma dose, tempo, tipo de administração e tipo celular dependente. As células HSC-3 mostraram-se mais sensíveis a estes efeitos que as células BICR-10. Às 48 horas, os CI50 nas células HSC-3 foi de 4,5 mM para ambos os anestésicos locais, enquanto as células BICR-10 atingiram o CI50 na concentração de 5,5 mM de Lidocaína e 10 mM de Mepivacaína. Estes resultados podem estar relacionados com o aumento da expressão de caspases e anião superóxido e com a redução do potencial de membrana observados, sugerindo o envolvimento da via mitocondrial da apoptose. A maior sensibilidade das células HSC-3 aos anestésicos locais pode estar relacionada com os níveis mais baixos de glutationa reduzida quando comparada com as células BICR-10. Nas células tratadas com Lidocaína e Mepivacaína na dose de CI50, o pico pré-G1 observado na análise do ciclo celular confirma a indução de morte por apoptose. A associação dos anestésicos locais com os fármacos quimioterápicos induziu um efeito antiproliferativo, com bloqueio do ciclo celular, predominantemente em fase S. Apesar de visível uma tendência para o aumento da expressão de E-Caderina, os anestésicos locais não alteraram significativamente a expressão das moléculas de adesão estudadas. No estudo da migração celular foi verificado que, os anestésicos locais em monoterapia e em combinação com a Cisplatina e 5-Fluorouracilo, levaram a uma redução da atividade proteolítica das metaloproteinases da matriz (efeito mais marcado na linha celular metastática). Foi ainda observado, no teste de scratch, uma inibição da migração celular das células tratadas XXIV com os anestésicos locais e sua combinação com quimioterápicos convencionais após 24 horas de incubação. Como conclusão, podemos referir que o nosso estudo in vitro mostrou que tanto a Lidocaína como a Mepivacaína, em monoterapia e em combinação com os fármacos usados na quimioterapia convencional, podem apresentar-se como uma terapêutica nova e complementar no CECCO, nomeadamente no CECCO metastático