Role of reactive oxygen species in inflammasome activation in microgalia under stress conditions

Trabalho final de mestrado integrado em Medicina área científica de Biologia Celular, apresentado á Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraIntroduction: Microglial cells are the resident immune cells of the Central Nervous System (CNS) intervening in adaptive immune responses by activating the inflammasome, which converts pro-IL-1β to its active form in response to diverse stimuli such as endoplasmic reticulum stress (ER stress) that is induced by the overload of misfolded protein in the ER lumen. Both ER stress and activation of inflammasome have been implicated in the pathogenesis of neurodegenerative diseases, namely in Alzheimer’s disease (AD). However, the relationship between changes in ER proteostasis and neuroinflammation is still unclear. In this work we studied the involvement of ER stress in activation of the NLRP3 inflammasome in microglia. Methods: ER stress was induced in the microglia cell line BV2 with brefeldin A (BFA). Using Western blot, MTT, Amplex Red and ELISA assays, the levels of ER stress markers, cell viability, inflammasome activation and generation of reactive oxygen species (ROS) were evaluated. Results: We demonstrated that ER stress activates the NLRP3 inflammasome in microglial cells leading to the release of IL-1β. Furthermore, we showed that ER stress increases the production of ROS, which might act as an intermediate step between loss of ER proteostasis and inflammasome activation. Finally, we provided evidence that microglia cell survival is significantly compromised in response to ER stress. Discussion: These data support that chronic induction of an ER stress response in microglia due to the accumulation of misfolded proteins in the ER lumen, which is characteristic of several neurodegenerative disorders, is followed by ROS generation and activation of the NLRP3 inflammasome. Prolonged ER stress, through several signaling pathways that trigger cell death mechanisms, decreases the viability of microglia cells. However, it remains to be determined whether NLRP3 activation under stress conditions is dependent from ROS accumulation in this cell type. Conclusion: We provide evidence for a causal link between loss of proteostasis due to ER stress and inflammasome activation in microglia, a mechanism that might be implicated in neuroinflammation in protein misfolding neurodegenerative diseases.Introdução: As células da microglia são células imunitárias residentes no Sistema Nervoso Central (SNC) que intervêm na resposta imunitária adaptativa, ativando o inflamassoma que por sua vez converte a pró-interleucina 1β na sua forma ativa, em resposta a diversos estímulos como o stresse do retículo endoplasmático (RE) que é induzido pela acumulação de proteínas desenroladas no lúmen do RE. Tanto o stresse do RE como a ativação do inflamassoma estão envolvidos na patogénese de diversas patologias neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (DA). No entanto, a relação entre a alteração da proteostase do RE e a neuroinflammação ainda não é clara. Neste projeto estudámos o envolvimento do stresse do RE na ativação do inflamassoma NLRP3 em células da microglia. Métodos: O stresse do RE foi induzido na linha celular de microglia BV2 utilizando brefeldina A (BFA) e os níveis de marcadores de stresse do RE, viabilidade celular, ativação do inflamassoma e produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) foram avaliados por Western blott, MTT, Amplex Red e ELISA, respetivamente. Resultados: Demonstrámos que o stresse do RE induz a ativação do Inflamassoma NLRP3 em células de microglia levando à libertação de IL-1β. Além disso, os nossos resultados mostram que o stresse do RE estimula a produção de ROS, o que pode atuar como um passo intermédio entre a perda de proteostase no RE e a ativação do inflamassoma. Demonstrámos ainda que a sobrevivência de células de microglia está significativamente comprometida em resposta ao stresse do RE. Discussão: Os nossos resultados suportam a hipótese de que a indução crónica de uma resposta ao stresse do RE nas células da microglia devido à acumulação de proteínas mal enroladas no lúmen do RE, característica de diversas doenças neurodegenerativas, aumenta a produção de ROS e induz ativação do inflamassoma NLRP3. O stresse prolongado do RE através da ativação de várias vias de sinalização que desencadeiam mecanismos de morte celular, reduz a viabilidade das células da microglia. No entanto, fica por esclarecer se a ativação do inflamassoma NLRP3 em condições de stresse é dependente da acumulação de ROS nestas células. Conclusão: Este trabalho evidencia a existência de uma ligação causal entre a perda de proteostase devido a stresse do RE e a ativação de inflamassoma na microglia, que poderá estar envolvida na neuroinflamação que ocorre em doenças neurodegenerativas em que há acumulação de proteínas mal enroladas