Molecular epidemiology of Staphylococcus aureus clinical isolates in children

Introduction: Staphylococcus aureus infections cause significant morbidity and mortality in children and adolescents. There is limited data on the characteristics of S. aureus infections requiring hospitalization in childhood. Aim of this study was to investigate the molecular epidemiology and antibiotic resistance of S. aureus clinical isolates from children and adolescents.Methodology: This cohort study included all S. aureus isolates recovered from children and adolescents younger than 18 years who were admitted to the University Hospital of Heraklion, Crete from 1 January 2015 to 31 December 2018. Medical records were reviewed for demographic and clinical characteristics. Infections were classified into (I) skin and soft tissue infections (SSTIs) such as impetigo, cellulitis, abscess, omphalitis, (II) toxin-mediated disease (TMD) including staphylococcal scalded skin syndrome and toxic shock syndrome and (III) invasive disease (INV) including septicaemia, pneumonia, osteomyelitis, and septic arthritis. Infections with positive cultures obtained from normally sterile fluids, including CSF, blood and synovial fluid were considered invasive infections. Infections and the recovered isolates were classified as community-associated (CA), community-onset healthcare-associated (COHA) and hospital-associated (HA) based on established CDC criteria. To examine possible changes over time, we studied subsets of isolates collected during two periods: 2015–2016 (period A) and 2017–2018 (period B).The isolates were identified by conventional methods, including colony morphology, Gram staining, standard biochemical tests and by the automated Vitek 2 system (bioMérieux, Marcy l’ Etoile, France). Antimicrobial susceptibilities were interpreted according to the 2018 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) criteria. S. aureus ATCC 25923 and S. aureus ATCC 43300 were used as control strains. Isolates were phenotypically classified as methicillin susceptible S. aureus (MSSA) or MRSA based on the cefoxitin disc diffusion test and the latex agglutination test for the detection of PBP2a (bioMerieux). Inducible resistance to clindamycin was tested by d-test as per CLSI guidelines. S. aureus isolates that were resistant to cefoxitin were phenotypically classified as MRSA and verified by PCR for mecA or mecC gene carriage. Genes encoding Panton–Valentine leukocidin (lukS/lukF-PV), toxic shock syndrome toxin-I (tst), exfoliative toxins (eta, etb), fibronectin binding proteins A and B (fnbA, fnbB) were investigated by polymerase chain reactions with specific primers. Isolates were classified into main pulsotypes and subtypes by PFGE of chromosomal DNA SmaI digests performed in a CHEF DR III apparatus (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). A dendrogram comparing molecular weights of strains’ DNA fragments was performed by FPQuest software version 4.5. (Bio-Rad Laboratories). Representative isolates of the main PFGE types, including all MRSA and selected MSSA isolates, were further characterized by MLST to sequence types (STs), based on the online MLST database (https://pubmlst.org/organisms/ staphylococcus-aureus). Statistical analysis for categorical variables, chi-square or two-tailed Fisher’s exact test were conducted to calculate p values and odds ratios. For continuous variables, statistical significance of observed associations was evaluated using Mann–Whitney U-test. Antibiotic susceptibility trends and MLST trends were analysed using chi-square for trend. The level of significance was set at p value less than 0.05. Statistical analysis was conducted using GraphPad Prism 9.1.0.Results: During the 4-year study period, 139 non-duplicated S. aureus isolates were collected from children and adolescents (77 boys, 62 girls) with invasive and non-invasive infections. Sixteen (11.5%) isolates were MRSA and 123 (88.5%) were MSSA. The mean age of patients was 3.8 years (median age; 2.02 years) and it did not differ between children with MSSA and those with MRSA. S. aureus isolates were derived most frequently from skin and soft tissue infections (SSTIs; 94/139, 67.6%), followed by toxin-mediated disease (TMD; 23/139,16.5%, all 23 cases were SSSS) and invasive infections (INV; 22/139,15.8%). Pneumonia (9/22), bacteraemia (4/22) and osteoarticular infections (6/22) were the most common invasive S. aureus infections. MRSA isolates did not differ with regards to gender, length of stay, infection type, PICU admission as compared to MSSA and there was no associated mortality. All isolates recovered from children with TMD were MSSA. Most isolates were classified as CA (102/139; 73.4%), while HA and COHA were less common (20/139;14.4% and 17/139; 12.2%, respectively). A total of 52 isolates belonged to children with comorbidities or prolonged hospital-stay, including neonates (38 isolates), children with cystic fibrosis (seven isolates), children admitted to PICU (six isolates) and one child with malignancy. HA and COHA-isolates were more commonly isolated from these children (OR 2.8, 95%CI 1.27–5.78, p 0.01) and were more commonly associated with invasive disease (OR 4.41, 95%CI 1.71–10.79, p 0.001). Of 139 S. aureus isolates, 93.5% were resistant to penicillin, 35.9% to fusidic acid, 7.2% to mupirocin, 22.3% to tobramycin, 18.7% to erythromycin, 16.5% to clindamycin and 9.3% to tetracycline. Among 26 erythromycin-resistant isolates, prevalence of constitutive (cMLSB), inducible (iMLSB) and MS resistance phenotypes was 53.9, 34.6 and 11.5%, respectively. Resistance to clindamycin and tetracycline was higher among MRSA isolates (p 0.02 and p 0.001, respectively). MRSA and MSSA isolates did not differ regarding cMLSB and iMLSB resistance phenotype (OR 0.20, 95%CI 0.03–1.39, p 0.16). None of the S. aureus isolates were resistant to vancomycin, rifampicin, linezolid or teicoplanin. All phenotypically cefoxitin-resistant isolates were also oxacillin-resistant, carrying mecA and were characterized as MRSA. Fusidic acid resistance was more common in isolates derived from SSTI and TMD infections (OR 7.2, 95%CI 2.42–20.3, p 0.0002). We did not observe significant differences in methicillin resistance among CA and HA isolates (OR 2.78, 95%CI 0.66–12.79, p 0.17). CA-isolates were highly resistant to penicillin compared to healthcare-associated isolates (OR 75.2, 95%CI 22.7–223.4, p <0.0001) and they did not differ regarding resistance to other antimicrobials.Methicillin resistance declined significantly from 18.3% in period A to 6.3% in period B (p 0.03). A significant increase in fusidic acid and mupirocin resistance was observed (fusidic acid resistance x2 test for trend, P 0.01; mupirocin resistance x2 test for trend, p <0.0001).All 139 isolates were tested for virulence genes; 13 isolates (9.4%) harboured lukS/lukF-PV, 27 (19.4%) eta, six (4.3%) etb, 13(9.4%) tst, 125 (89.9%) fnbA and 21 (15.1%) fnbB genes. MRSA showed higher detection rates of lukS/lukF-PV and tst genes as compared to MSSA isolates and MSSA showed higher rates of eta gene carriage. Detection rates of eta gene was also higher among isolates derived from TMD as compared to those causing INV/ SSTIs (OR 3.5, 95%CI 1.36–9.29, p 0.01). MSSA isolates showed polyclonality by PFGE and were classified into 20 pulsotypes including one to 40 strains each. However, two predominant pulsotypes were identified: type 1 with ten subtypes (ST121) including 40 strains and type 2 with seven subtypes and 16 strains. Sixteen PFGE types included one to eight MSSA strains each. Two additional MSSA were classified to PFGE types C (ST80) and H (ST225). MRSA belonged to four pulsotypes; type A: four strains (ST30), B: four strains (ST239), C: five strains (ST80) and H: three strains (ST225). Multilocus sequence typing identified five sequence types among the 58 tested isolates. All 23 isolates from children with SSSS were characterized by MLST. Pulsotype 1, ST121 was predominant (13/23, 56.5%, p 0.002). Of 23 SSSS isolates, nine isolates (39.1%) were shown to carry eta gene, three (13%) carried etb, one isolate (4.3%) carried both eta and etb. Isolates harbouring eta or etb genes all belonged to PFGE type1, ST121. In our study, 40 isolates belonged to ST121, all of them were MSSA and CA in their majority (31/40, 77.5%). As compared to other isolates, ST121 was highly resistant to fusidic acid (80%), tobramycin (35%), mupirocin (25%) and clindamycin (25%), rarely carried PVL and tst genes (3/40 and 0/40, respectively) but harboured epidermolysin genes (eta 27/40; etb 6/40; both eta and etb 4/40) and genes facilitating adherence to the epithelium (fnbA 40/40) and causing mainly SSTIs (26/40), SSSS (13/40) and one case of invasive disease. Compared to other pulsotypes, mupirocin resistance and presence of eta/etb genes was exclusively linked to pulsotype 1 (p <0.0001).Conclusion: In our population, community-associated MSSA was the predominant cause of S. aureus infections characterized by polyclonality, increasing resistance to fusidic acid and mupirocin. PFGE type 1 ST121 clone, harboured exfoliative toxins genes and was associated with rising trends of SSSS.Εισαγωγή: O χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus, S. aureus) είναι ένα συχνό παθογόνο που προκαλεί μεγάλο εύρος λοιμώξεων στον άνθρωπο. Ποσοστό 20% του γενικού πληθυσμού είναι φορείς του S. aureus και η φορία παρουσιάζει δικόρυφη κατανομή με υψηλά ποσοστά κατά τις πρώτες 8 εβδομάδες ζωής και κατά τη διάρκεια της εφηβείας. Ο S. aureus αποτελεί το αίτιο πολλών διεισδυτικών και μη διεισδυτικών λοιμώξεων όπως είναι η βακτηριαιμία, πνευμονία, μηνιγγίτιδα, λοιμώδης ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις οστών και αρθρώσεων και λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων καθώς και νόσων διαμεσολαβούμενων από τοξίνη. Τα τελευταία χρόνια, έχουν αναδυθεί και εξαπλωθεί στελέχη κοινότητας ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη (CA-MRSA) που προκαλούν επιδημίες λοιμώξεων δέρματος και μαλακών μορίων παγκοσμίως. Η αύξηση αυτή είναι πιο εμφανής σε μικρές ηλικίες και φαίνεται να σχετίζεται με την επικράτηση συγκεκριμένων κλώνων ανά γεωγραφική περιοχή. Επίσης πρόσφατα έχει περιγραφεί η αύξηση των περιπτώσεων σταφυλοκοκκικού συνδρόμου αποφολίδωσης του δέρματος (Staphylococcal Scalded Skin Syndrome, SSSS), μιας νόσου διαμεσολαβούμενης από τοξίνη που απαντάται σπάνια σε ενήλικες με υποκείμενα νοσήματα ή ανοσοκαταστολή ενώ είναι συχνή στα νεογνά και στα παιδιά. Υπεύθυνα είναι στελέχη S. aureus που παράγουν αποφολιδωτικές τοξίνες (ETA, ETB). Τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον στρέφεται στην κατανόηση των παθογενετικών μηχανισμών που έχουν προκαλέσει την αύξηση των λοιμώξεων από S. aureus και την επικράτηση συγκεκριμένων κλώνων όπως στελεχών CA-MRSA με λοιμογόνους παράγοντες όπως η λευκοκτονίνη Panton-Valentine (PVL) και η α-αιμολυσίνη. Υλικά και μέθοδοι: Μελετήθηκαν παιδιά και έφηβοι κάτω των 18 ετών που νοσηλεύτηκαν λόγω λοίμωξης από S. aureus επιβεβαιωμένης με καλλιέργεια υλικού στα παιδιατρικά τμήματα και στις ειδικές μονάδες του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου από 1η Ιανουαρίου 2015 έως και 31 Δεκεμβρίου 2018. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν καλλιέργειες δερματικών βλαβών, πύου, υλικού παρακεντήσεων, αίματος, πτυέλων, βρογχικού εκπλύματος, εγκεφαλονωτιαίου υγρού καθώς και καλλιέργειες ρινικού επιχρίσματος σε περιπτώσεις νόσου διαμεσολαβούμενης από τοξίνη. Οι λοιμώξεις ταξινομήθηκαν με βάση το ιατρικό ιστορικό σε λοιμώξεις κοινότητας (Community-associated, CA), νοσοκομειακές λοιμώξεις (Hospital-associated, HA) και νοσοκομειακές λοιμώξεις με έναρξη στην κοινότητα (Community onset, Healthcare-Αssociated, COHA) και καταγράφηκαν οι κλινικές εκδηλώσεις, η διάρκεια νοσηλείας και η έκβασή τους. Για τις καλλιέργειες των κλινικών δειγμάτων ακολουθήθηκαν οι συμβατικές μέθοδοι. Η ταυτοποίηση των στελεχών S. aureus έγινε με βάση τη μορφολογία των αποικιών, τη χρώση Gram, τη δοκιμασία καταλάσης και πηκτάσης και με τη χρήση του αυτοματοποιημένου συστήματος Vitek2 (bioMérieux, Marcy l’ Etoile, France). Για τη ερμηνεία των αποτελεσμάτων ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά χρησιμοποιήθηκαν τα κριτήρια Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) του 2018. Για τον ποιοτικό έλεγχο χρησιμοποιήθηκαν τα πρότυπα στελέχη S. aureus ATCC 25923 και S. aureus ATCC 43300. Τα στελέχη ταξινομηθήκαν φαινοτυπικά σε ευαίσθητα στη μεθικιλλίνη (MSSA) ή ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη (MRSA) με βάση τη δοκιμασία διάχυσης δίσκων κεφοξιτίνης και τη δοκιμασία latex συγκόλλησης για την ανίχνευση της PBP2a (bioMerieux). Για την ανίχνευση της επαγώγιμης αντοχής στην κλινδαμυκίνη χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία D-test σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI. H παρουσία των γονιδίων που κωδικοποιούν την λευκοκτονίνη Panton–Valentine (lukS/lukF-PV), του γονιδίου της τοξίνης του συνδρόμου της τοξικής καταπληξίας I (tst), των γονιδίων των αποφολιδωτικών τοξινών (eta, etb) και των προσκολλητινών A και B (fnbA,fnbB) ελέγχθηκαν με PCR. Ακολούθως τα στελέχη S. aureus τυποποιήθηκαν με τη χρήση ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE). Τα αποτελέσματα της PFGE συσχετίσθηκαν και σχεδιάστηκε ένα δενδρόγραμμα συγκρίνοντας τα μοριακά βάρη των θραυσμάτων DNA μέσω του προγράμματος FPQuest (Bio-Rad). Στη μελέτη μας, πραγματοποιήθηκε πολυτοπική νουκλεοτιδική ανάλυση (Multi Locus Sequence Typing, MLST) σε αντιπροσωπευτικά στελέχη με βάση το φαινότυπο αντοχής στα αντιβιοτικά και τους τύπους PFGE. Χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα eBURST (http://eburst.mlst.net) προκειμένου να καθοριστούν τα κλωνικά συμπλέγματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με την εφαρμογή των δοκιμασιών χ2 ή two-tailed Fisher’s exact test για τις κατηγορικές μεταβλητές και υπολογίστηκαν τα p values και odds ratios. Για τις συνεχείς μεταβλητές, η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε με τη χρήση της δοκιμασίας Mann–Whitney. Οι τάσεις σε ότι αφορά την αντοχή στα αντιμικροβιακά και στους τύπους κατά MLST αναλύθηκαν με τη χρήση της δοκιμασίας χ2 chi square for trend. Το όριο της στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε ως p value <0.05. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του λογισμικού Graphpad version 9.1.0.Αποτελέσματα: Κατά την διάρκεια της τετραετίας 2015 έως 2018, εντοπίσθηκαν 139 στελέχη χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου από παιδιά και εφήβους που νοσηλεύτηκαν με διεισδυτικές και μη διεισδυτικές λοιμώξεις στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Ηρακλείου. Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 77 αγόρια και 62 κορίτσια. Η πλειοψηφία των στελεχών ήταν MSSA (123 στελέχη, 88.5%) και 16 ήταν MRSA (11.5%). Η μέση ηλικία διάγνωσης ήταν τα 3.8 έτη (διάμεσος 2.02 έτη). Ποσοστό 67.7% των στελεχών (94/136) απομονώθηκαν από λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων ενώ οι διεισδυτικές λοιμώξεις (22/139, 15.8%) και οι λοιμώξεις διαμεσολαβούμενες από τοξίνη (ΤΜD) ήταν σπανιότερες (23/139, 16.5%). Τα περισσότερα στελέχη ανήκαν σε στελέχη κοινότητας (CA), ενώ τα νοσοκομειακά στελέχη και τα νοσοκομειακά στελέχη με έναρξη στην κοινότητα ήταν λιγότερο συχνά [CA (102/139, 73.4%), HA (20/139,14.4%) και COHA 17/139; 12.2%, αντίστοιχα]. Συνολικά 52 στελέχη ανήκαν σε παιδιά με χρόνια νοσήματα ή παρατεταμένη ενδονοσοκομειακή νοσηλεία. Η μέση διάρκεια νοσηλείας ήταν 7.5 ημέρες (1-70 ημέρες). Παιδιά με λοιμώξεις από στελέχη MRSA δεν διέφεραν ως προς την διάρκεια νοσηλείας σε σχέση με MSSA στελέχη (p 0.87). Κατά το διάστημα παρακολούθησης δεν διαπιστώθηκαν θάνατοι. Σε ότι αφορά τους φαινότυπους αντοχής, ποσοστό 93.5% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην πενικιλλίνη, 35.9% στο φουσιδικό οξύ, 7.2% στη μουπιροσίνη, 22.3% στην τομπραμυκίνη, 18.7% στην ερυθρομυκίνη, 16.5% στην κλινδαμυκίνη και 9.3% στην τετρακυκλίνη. Ανάμεσα στα 26 στελέχη που παρουσίαζαν αντοχή στην ερυθρομύκινη, ποσοστό 53.9%, 34.6%, και 11.5% αντίστοιχα παρουσίαζαν φαινότυπο αντοχής cMLSB, iMLSB και MS αντίστοιχα. Τα στελέχη MRSA και MSSA δεν διέφεραν ως προς τους φαινοτύπους αντοχής cMLSB και iMLSB (OR 0.20, 95% CI 0.03-1.39, p 0.16). Κανένα στέλεχος δεν παρουσίαζε αντοχή στην βανκομυκίνη, ριφαμπικίνη, λινεζολίδη και τεϊκοπλανίνη. Όλα τα στελέχη που ήταν φαινοτυπικά ανθεκτικά στην κεφοξιτίνη, ήταν επίσης ανθεκτικά στην οξακιλλίνη και έφεραν το γονίδιο mecA. Κατά την διάρκεια μελέτης, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων από στελέχη MSSA [OR 3.32 95%CI (1.18-8.96) p 0.03, x2 5.56 df:1, p 0.02] καθώς και στατιστικά σημαντική αύξηση των περιπτώσεων SSSS (x2 for trend 5.36, df1, p 0.02). Παράλληλα, παρατηρήθηκε μια σημαντική αύξηση της αντοχής σε φουσιδικό οξύ και μουπιροσίνη (φουσιδικό οξύ, x2 test for trend, p 0.01; μουπιροσίνη x2 test for trend, p <0.0001). Οι αυξητικές τάσεις της αντοχής της μουπιροσίνης συσχετίσθηκαν με αύξηση των ανθεκτικών στη μουπιροσίνη στελεχών MSSA (p <0.0001). Όλα τα στελέχη (Ν=139) εξετάστηκαν για την ύπαρξη λοιμογόνων γονιδίων. Από αυτά, 13 στελέχη (9.4%) ήταν lukS/lukF-PV θετικά, 27 (19.4%) eta θετικά, έξι (4.3%) etb θετικά, 13 (9.4%) tst θετικά, 125 (89.9%) fnbA θετικά και 21 (15.1%) fnbB θετικά. Τα στελέχη MRSA παρουσίαζαν υψηλότερα ποσοστά γονιδίων lukS/lukF-PV και tst σε σύγκριση με τα MSSA ενώ τα MSSA είχαν υψηλότερα ποσοστά γονιδίων eta (Πίνακας 8). Τα στελέχη MSSA παρουσίασαν πολυκλονικότητα κατά PFGE και ταξινομήθηκαν σε 20 τύπους κάθε ένας από τους όποιους περιελάμβανε 1 έως 40 στελέχη. Ανιχνεύτηκαν δυο κυριάρχοι τύποι, ο τύπος 1 με 10 υποτύπους (ST121) που περιελάμβανε 40 στελέχη και ο τύπος 2 με 7 υποτύπους και 16 στελέχη. Συνολικά, 16 PFGE τύποι συμπεριέλαβαν ένα έως 8 στελέχη MSSA ο καθένας. Επιπλέον, δύο στελέχη MSSA ταξινομήθηκαν στους PFGE τύπους C (ST80) και H (ST225). Τα στελέχη MRSA ανήκαν σε 4 τύπους: στον τύπο Α ανήκαν 4 στελέχη (ST30), στον τύπο Β: 4 στελέχη (ST239), στον τύπο C: 5 στελέχη (ST80) και στον τύπο Η: 3 στελέχη (ST225). Κατά MLST μελετήθηκαν 58 αντιπροσωπευτικά στελέχη εκ των οποίων όλα τα στελέχη απομονώθηκαν από παιδιά με λοιμώξεις διαμεσολαβούμενες από τοξίνη (SSSS). Ανάμεσα στα στελέχη που απομονώθηκαν από SSSS, o τύπος PFGE 1, ST121 ήταν ο κυρίαρχος τύπος (13/23, 56.5%, p 0.002). Στη μελέτη μας, 40 στελέχη ανήκαν στον τύπο ST121, εκ των οποίων όλα ήταν MSSA και παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα αντοχής στο φουσιδικό οξύ (80%), στην τομπραμυκίνη (35%), μουπιροσίνη (25%) και στην κλινδαμυκίνη (25%), σπανίως έφεραν γονίδια PVL και tst (3/40 και 0/40 αντίστοιχα) αλλά ήταν θετικά για γονίδια eta ή/και etb (eta 27/40, etb 6/40, eta και etb 4/40) καθώς και γονίδια που επιτρέπουν την προσκόλληση στο επιθήλιο (fnbA 40/40). Ο τύπος PFGE 1 προκαλούσε κυρίως SSTIs (26/40) και SSSS (13/40) ενώ καταγράφηκε μία περίπτωση διεισδυτικής νόσου. Συγκριτικά με τους άλλους τύπους, η αντοχή στη μουπιροσίνη και η παρουσία των γονιδίων eta/etb ήταν αποκλειστικά συνδεδεμένη με τον τύπο 1 (p