Development of root clearing for 3D imaging of arbuscular mycorrhizal symbiosis

La vigne, comme la majorité des espèces de plante d’intérêt agronomique, forme une symbiose mutualiste avec les Champignons Mycorhiziens à Arbuscules (CMA). En contrepartie de produits issus de la photosynthèse, les CMA soutiennent leur(s) plante(s) hôte(s) dans l’acquisition de nutriments et la lutte contre leur(s) pathogène(s). En tant que biofertilisants, ces symbiontes obligatoires représentent une alternative de choix à l’égard des pratiques agricoles conventionnelles pour le développement d’une viticulture durable. Les échanges entre les deux partenaires sont permis par la mise en place de structures fongiques spécialisées appelées arbuscules. La membrane plasmique végétale, en contact étroit avec l’arbuscule, appelée membrane périarbusculaire, présente des transporteurs de nutriments spécifiquement régulés. Le phosphore (P) est un élément clé pour la croissance des plantes, mais la majeure partie du P du sol n'est pas disponible pour les racines. Les plantes ne peuvent prélever que le phosphate inorganique (Pi) du sol à proximité de leurs racines et sont donc rapidement confrontées à son épuisement. En agriculture conventionnelle, cet épuisement est compensé par l'application d'engrais de synthèse. Cependant, les plantes mycorhiziennes peuvent prélever du Pi du sol soit par la voie directe (transporteurs exprimés au niveau de la membrane plasmique des cellules épidermiques des poils absorbants) soit par la voie mycorhizienne. La voie mycorhizienne peut améliorer la nutrition phosphatée des plantes en étendant l'exploration des sols, grâce aux hyphes du CMA, au-delà de la zone de déplétion en Pi. De plus, les arbuscules du CMA sont impliqués dans la translocation du Pi vers la cellule végétale à travers la membrane périarbusculaire.Afin de comprendre le rôle du P dans l’établissement et le maintien des échanges entre les partenaires symbiotiques, ma thèse se divise en deux axes. Mon premier objectif est de déterminer la répartition tri-dimensionnelle sur racine entière des transporteurs de P sur-exprimés lors de la mycorhization. Pour cela, il est nécessaire de rendre l’échantillon transparent par dépigmentation et homogénéisation des indices de réfraction à travers le tissu. Cette technique, appelée transparisation, permet l’acquisition d’un signal fluorescent en profondeur sans coupe histologique. J’ai donc mis au point un protocole de transpiration sur tissu racinaire. L’imagerie racinaire en microscopie confocale à balayage laser, jusqu’à lors limitée à une profondeur de 40µm sur racine non pigmentée, à cause de l’opacité du tissu, est dorénavant repoussée à 250µm d’épaisseur grâce à la transparisation, y compris sur racines pigmentées. Dans un second temps, j’ai réalisé un immunomarquage de transporteurs de phosphate sur-exprimés lors de la mycorhization. Cet immunomarquage fonctionne sur racine entière non pigmentée (Medicago truncatula, transporteur MtPT4) et pigmentée (Vitis vinifera, VvPT4.2). Le second objectif de ma thèse est de déterminer l'influence du P sur l'échange et le stockage de carbone entre les deux partenaires. En tant que symbiote obligatoire, le CMA a besoin d'un support et d'un approvisionnement en carbone. Le sucre (sous forme de glucose) est la principale source de carbone pour le CMA. Cependant, les CMA sont incapables de produire des acides gras (AG) et ont besoin de la plante pour cette synthèse. Lorsque la concentration en P dans le milieu de culture est élevée, les arbuscules ont tendance à se rétracter et à former des gouttelettes lipidiques visibles en microscopies photonique et électronique. Par des analyses spectrales innovantes sur tissus racinaires mycorhizés (infrarouge, visible et spectrométrie de masse), je cherche à trouver une approche permettant de déterminer la composition en AG des gouttelettes lipidiques, pour in fine, en comprendre la provenance (végétale ou fongique) et confirmer ou infirmer la présence d’une voix passive de transport d’AG lors de la mycorhization.Grapevine, like most plant species of agronomic interest, forms a mutualistic symbiosis with Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF). In return for products of photosynthesis, the AMF support their host plant(s) in acquiring nutrients and fighting their pathogen(s). As biofertilisers, these obligate symbionts represent a choice alternative to conventional agricultural practices for the development of agriculture, and in particular sustainable viticulture. Exchanges between the two partners are made possible by the establishment of specialised fungal structures called arbuscules. The plant plasma membrane, in close contact with the arbuscules, called the peribuscular membrane, has nutrient transporters that are specifically regulated in this symbiosis. Phosphorus (P) is a key element for plant growth, but most of the P in the soil is not available to the roots. Plants can only take up inorganic phosphate (Pi) from the soil near their roots and are therefore quickly faced with its depletion. In conventional agriculture, this depletion is compensated by the application of synthetic fertilisers. However, mycorrhizal plants can take up Pi from the soil either by the direct way (transporters expressed in the plasma membrane of the epidermal cells of the absorbing hairs) or thanks to the AMF. The mycorrhizal pathway can improve plant phosphate nutrition by extending soil exploration, through the hyphae of the AMF, beyond the Pi depletion zone. Furthermore, AMF arbuscules are involved in the translocation of Pi to the plant cell through the peribuscular membrane.In order to understand the role of P in the establishment and maintenance of exchanges between symbiotic partners, my thesis is divided into two main axes. My first objective is to determine the three-dimensional distribution of P transporters over-expressed or induced during mycorrhization. In order to acquire fluorescent signal over the entire root thickness, it is necessary to make the samples transparent by depigmenting and homogenising the different refractive indices within the tissue, via chemical treatments. This technique, called clearing, allows a three-dimensional analysis of the fluorescently labelled structures of interest on thick samples without histological sectioning. I first developed a root tissue clearing protocol. Root imaging using confocal laser scanning microscopy, which was previously limited to a depth of 40µm on non-pigmented roots due to the opacity of the tissue, is now extended to 250µm in thickness thanks to clearing process, including on pigmented roots. In a second step, I performed an immunolabelling of phosphate transporters overexpressed during mycorrhization. This immunolabelling is suitable with clearing of non-pigmented roots (Medicago truncatula, MtPT4 transporter) and on pigmented roots (Vitis vinifera, VvPT4.2 transporter). The second objective of my thesis is to determine the influence of P on the exchange and storage of carbon between the two partners. Indeed, as an obligate symbiont, the CMA needs a plant support and a carbon supply. According to the literature, sugar (glucose) is the main source of carbon for the AMF. However, AMFs are unable to produce fatty acids (FAs) and require plant for this synthesis. Studies have suggested the presence of an active FA transport pathway at the symbiotic interface. However, when the concentration of P in the culture medium is high, the arbuscules tend to shrink and form lipid droplets visible under photon and electron microscopy. These observations suggest a passive voice allowing the transport of FA from the plant to the AMF via these droplets. Using innovative spectral analyses on mycorrhizal root tissues (infrared, visible and mass spectrometry), I am looking for an approach to determine the FA composition of the lipid droplets, in order to ultimately understand their origin (plant or fungal) and confirm or deny the presence of a passive FA transport pathway during mycorrhization