Die enterische Muskulatur als Quelle des neurotrophen Faktors GDNF

Hintergrund dieser Arbeit Die Vermittlung der gastrointestinalen Motilität erfolgt vorrangig durch das Zusammenspiel des enterischen Nervensystems und der intestinalen Muskulatur. Entsprechend können gastrointestinale neuromuskuläre Pathologien zu teilweise schweren Störungen der gastrointestinalen Motilität führen, die u.a. auch bei der Divertikelkrankheit beschrieben wurden. Der neurotrophe Faktor glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) ist wesentlich beteiligt an der Entwicklung, Differenzierung und funktionellen Intaktheit des enterischen Nervensystems. Im Sinne des "Neurotropher-Faktor-Konzeptes" wird postuliert, dass GDNF vom Zielgewebe (enterische Muskulatur) produziert wird, um das Ausgangsgewebe (enterisches Nervensystem) für seine Aufgaben zu stimulieren (Innervation der enterischen Muskulatur). Fragestellung Vor diesem Hintergrund sollte im Tiermodell der Ratte zunächst die postnatale Entwicklung und Differenzierung der enterischen Muskulatur beschrieben sowie die ontogenetische Expression des GDNF-Systems (GDNF, GDNF-Rezeptoren) untersucht werden. In einem weiteren Ansatz sollte ein Zellkulturmodell enterischer Muskelzellen etabliert werden, um zu prüfen, ob es unter diesen in-vitro Bedingungen ebenfalls zur Expression des GDNF-Systems kommt. In einem abschließenden Schritt sollte untersucht werden, ob die GDNF-produzierenden kultivierten enterischen Muskelzellen vergleichbare neurotrophe Effekte auf das enterische Nervensystem aufweisen wie die alleinige Supplementierung von GDNF. Aus den Befunden sollten Rückschlüsse auf die bei der Divertikelkrankheit vorliegenden intestinalen Innervationsstörungen gezogen werden. Material und Methoden Zur Untersuchung der postnatalen Differenzierung der enterischen Muskulatur wurden der Dünn- und Dickdarm von Ratten unterschiedlicher Altersstufen (P2, P21, Adult) mit konventionellen histologischen (HE, Azan) und immunhistochemischen (Caldesmon) Färbemethoden behandelt. Mittels quantitativer realtime PCR wurde die Genexpression des GDNF-Systems (GDNF, GDNF-Liganden) untersucht. Zur Etablierung einer enterischen Muskelzellkultur wurden Muskelzellen vom Rattendarm des Stadiums P2/3 isoliert und kultiviert. Der glattmuskuläre Phänotyp wurde immunhistochemisch (Caldesomon, alpha-SMA) konfirmiert. Nach ein- und zweiwöchiger Kulturdauer wurde die Genexpression des GDNF-Systems (GDNF, GDNF-Liganden) mittels quantitativer realtime PCR untersucht. Da sich die enterischen Muskelzellen auch mit Neurobasalmedium kultivieren ließen, wurde ein Ko-Kulturmodell von enterischen Muskel- und Nervenzellen angelegt und die Proliferation der Nervenzellen im Vergleich zur alleinigen GDNF-Supplementierung untersucht. Ergebnisse Bezüglich der Ontogenese der enterischen Muskulatur im Dünn- und Dickdarm der Ratte konnte gezeigt werden, dass zu allen Zeitpunkten das GDNF-System exprimiert wurde. Die höchsten Expressionen von GDNF und seiner Rezeptoren wurden in frühen postnatalen Stadien beobachtet. Enterische Muskelzellen ließen sich erfolgreich kultivieren und behielten ihren kontraktilen Phänotyp. Zudem konnte die Expression von GDNF und seiner Rezeptoren nach ein- und zweiwöchiger Kulturdauer sowohl im Vollmedium als auch im Neurobasalmedium nachgewiesen werden. Nach Ko-Kultur von enterischen Muskelzellen und Nervenzellen wurde eine vergleichbare Proliferation und Differenzierung der neuronalen Netzwerke beobachtet wie unter alleiniger Exposition der kultivierten Nervenzellen mit GDNF. Schlussfolgerung Die erhobenen Befunde lassen den Rückschluss zu, dass die enterische Muskulatur, insbesondere während früher postnataler Entwicklungsstadien, das GDNF-System exprimiert und in der Lage ist, die Entwicklung und Differenzierung des enterischen Nervensystems zu fördern. Damit konnte zum einen das "Neurotropher-Faktor-Konzept" auf Ebene des Gastrointestinaltraktes belegt und zum anderen die funktionelle Bedeutung der enterischen Muskulatur für eine regelrechte Ausdifferenzierung des enterischen Nervensystems aufgezeigt werden. Hinsichtlich der Pathogenese der Divertikelkrankheit wäre es entsprechend vorstellbar, dass der hier beobachtete Nervenzellverlust (enterische Neuropathie) durch ein Defizit von durch die enterische Muskulatur produzierten neurotrophen Faktoren (enterische Myopathie) bedingt ist. Darüber hinaus bietet das in dieser Arbeit etablierte Kulturmodell enterischer Muskelzellen die Möglichkeit, das Spektrum gastrointestinaler Motilitätsstörungen unter standardisierten in-vitro Bedingungen weiter zu untersuchen und insbesondere die funktionelle Beziehung zwischen enterischer Muskulatur und Nervensystem näher aufzuklären.Background Mediation of gastrointestinal motility is primarily generated by the interaction of the enteric nervous system and the enteric musculature. Therefore gastrointestinal neuromuscular pathologies could cause severe gastrointestinal motility disorders as they have been described in patients with diverticular disease. Glial cell line-derived neurotrophic factor GDNF is significantly involved in the development, differentiation and functional integrity of the enteric nervous system. The "neurotrophic factor concept” postulates that GDNF is produced by the target tissue (enteric muscles) in order to stimulate the tissue of origin (enteric nervous system) for its function (innervation of the enteric muscles). Aim of the study Against this background the postnatal development and differentiation of the rat enteric muscles as well as the ontogenetic expression of the GDNF system (GDNF, GDNF receptors) should be analyzed in an animal model. In another approach, a cell culture model of enteric muscle cells should be established in order to investigate whether an expression of the GDNF system could be observed under in-vitro conditions. Finally the neurotrophic effects of the GDNF-producing cultured enteric muscle cells on the enteric nervous system should be studied and compared to those of an exclusive supplementation of GDNF. The results should be used to explain the dysfunction of the enteric innervation in motility disorders like the diverticular disease. Material and methods In order to examine the postnatal differentiation of the enteric musculature small and large intestine of rats of different ages (P2, P21, adult) were prepared with conventional histological (HE, Azan) and immunohistochemical (caldesmon) staining. Gene expression of GDNF system (GDNF, GDNF ligands) was investigated by using quantitative real time PCR. To establish an enteric muscle cell culture model enteric muscle cells were isolated and cultured from intestines of rats of stage P2/3. The smooth muscle phenotype was confirmed immunohistochemically (Caldesomon, alpha-SMA). After one and two weeks of culturing, gene expression of the GDNF system (GDNF, GDNF ligands) was examined by quantitative real time PCR. As the enteric muscle cells could be cultivated with neurobasal medium, a co-culture model of enteric muscle and nerve cells has been carried out in order to study the proliferation of nerve cells in comparison to an exclusive GDNF supplementation. Results Concerning the ontogenesis of the enteric muscles in the small and large intestine of rats, it has been shown that the GDNF system has been expressed at all time points regarded. The highest expression of GDNF and its receptors has been observed in early postnatal stages. Enteric smooth muscle cells could be cultivated successfully and retained their contractile phenotype. Additionally, expression of GDNF and its receptors could be detected at one and two weeks of culture period in complete as well as in neurobasal medium. After co-culturing of enteric muscle cells and nerve cells, a similar proliferation and differentiation of neural networks was observed as well as under exclusive exposure of cultured neurons with GDNF. Conclusion These findings lead to the conclusion that enteric muscles express the GDNF system especially during early postnatal developmental stages and therefore are able to support the development and differentiation of the enteric nervous system. Thereby firstly the "neurotrophic factor concept” could be proved at the level of the gastrointestinal tract and, secondly, the functional importance of the enteric muscles for a proper differentiation of the enteric nervous system could be demonstrated. Accordingly, in regard to the pathogenesis of diverticular disease, it would be conceivable that the observed neuronal loss (enteric neuropathy) is caused by a deficit of neurotrophic factors produced by the enteric muscles (enteric myopathy). In addition, the established culture model of enteric muscle cells provides the opportunity to investigate other gastrointestinal motility disorders under standardized in-vitro conditions and to elucidate particularly the functional relationship between enteric muscles and nervous system in more detail