Changes in function of mitochondrial respiratory chain in pulmonary artery smooth muscle cells under conditions of chronic hypoxia : measurements by respirometry and remission-spectrophotometry

Die hypoxische pulmonale Vasokonstriktion (HPV) ist eine physiologische Anpassungsreaktion der Lungengefäße an Hypoxie. Dieser als von-Euler-Liljestrand-Mechanismus bekannte Vorgang dient zur Optimierung des Gasaustausches. Unter chronischer Hypoxie (z.B. COPD, Höhenaufenthalt) kommt es jedoch zu pathologischen Umbauvorgängen, die zu vaskulärem Remodeling und pulmonaler Hypertonie führen können. Als Sensor- und Effektorzellen konnten pulmonalarterielle glatte Gefäßmuskelzellen (PASMCs) identifiziert werden, welche durch Ca2+-Einstrom kontrahieren und angeregt durch Transkriptionsfaktoren, wie z.B. HIF proliferieren. Mitochondrien sind sowohl am akuten Sauerstoffsensing als auch bei den chronischen Remodelingprozessen beteiligt. Möglicherweise spielen dabei die mitochondriale ROS-Produktion und metabolische Veränderungen eine Rolle. Ziel dieser Arbeit war es daher zu untersuchen, ob sich die mitochondriale Atmung sowie der Redox-Status mitochondrialer Atmungskettencytochrome in PASMCs unter chronischer Hypoxie verändern. Verglichen wurden die Ergebnisse mit Veränderungen in aortalen SMCs (ASMCs). In einer kombinierten Messung aus Respirometrie und Remissions-Spektrophotometrie wurden die mitochondriale Sauerstoffaffinität, die mitochondriale Atmung und der Redox-Status der Cytochrome untersucht. Nach Etablierung eines validen Zellkulturmodels wurden Messungen an 24 Std und 48 Std hypoxisch (1 % O2) inkubierten Zellen durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass bei Verwendung von 10 % FCS im Versuchsmedium die Zellkulturbedingungen hinsichtlich Aussaat oder Passage keinen Einfluss auf die Sauerstoffaffinität (p50) oder den maximalen Sauerstoffverbrauch (Vmax) haben. Serumarme Zellen (1 % FCS) dagegen wiesen im Vergleich zu serumreichen Zellen (10 % FCS) niedrigere Werte für beide Parameter auf. Nach hypoxischer Inkubation wurde nach 24 Std eine Abnahme von Vmax gesehen, welche nach 48 Std zunahm. Eine Reduktion der Sauerstoffaffinität konnte nach 48 Std hypoxischer Inkubation detektiert werden. Dabei veränderte sich die Mitochondrienzahl, gemessen an der Citrat-Synthase-Aktivität, nicht. In aortalen Vergleichszellen nahm die Sauerstoffaffinität nach 24 Std hypoxischer Inkubation stärker als in PASMCs ab, der maximale Sauerstoffverbrauch war vergleichbar mit demjenigen in PASMCs. In der Spektrophotometrie zeigte sich kein Unterschied in der pO2-abhängigen cytochromalen Reduktion bei hypoxisch inkubierten Zellen. Zusammenfassend zeigte sich eine verminderte Atmung und Sauerstoffaffinität hypoxisch inkubierter PASMCs, die möglicherweise Auswirkungen auf die Proliferation und das vaskuläre Remodeling unter chronischer Hypoxie haben.Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) is a physiological response of the lung to hypoxia and is also known as von-Euler-Liljestrand-mechanism, which optimizes blood perfusion to ventilation. In contrast, chronic hypoxia (as occuring in COPD or high altitude) leads to pathological changes and can result in pulmonary hypertension (PH) and vascular remodeling. The precapillary pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) could be identified as sensor- and effector cells as they contract and proliferate in response to hypoxia mediated by Ca2+-entry and transcription factors, e.g. HIF. Mitochondria take part in both, acute oxygen sensing and chronic remodeling processes. Mitochondrial ROS-production and metabolic changes are discussed to be essential for these alterations. Aim of this dissertation was to investigate, if mitochondrial respiration and cytochromal redox-state of the mitochondrial respiratory chain complexes in PASMCs show alterations under conditions of chronic hypoxia. These results were compared to aortal SMCs (ASCMs). The protocol consisted of a combination of respirometry and remissions-spectrophotometry to analyze mitochondrial oxygen affinity, oxygen consumption and cytochromal redox state. After establishment of a valid cell culture model, measurements in cells after 24 and 48 hours of hypoxic incubation (1 % O2) were performed. It could be shown that cell culture conditions with regard to passage or sowing did not have any effect on oxygen affinity (p 50) or oxygen consumption (Vmax). Cells incubated with 1 % FCS showed a decrease in both values compared to cells cultured with 10 % FCS. After hypoxic incubation (1 % O2), a decrease in Vmax after 24 hours could be detected, which was increased after 48 hours. In contrast, a decrease of oxygen affinity only could be seen after 48 hours of hypoxic incubation. During 24 hours hypoxic incubation, the number of mitochondria was constant, measured by citrate synthase activity. In comparison to pulmonary artery cells, in aortal cells oxygen affinity was more reduced after 24 hours of hypoxic incubation with similar values of oxygen consumption. In spectrophotometry, no significant difference in pO2-dependent reduction of cytochromes could be found. In conclusion, pulmonary artery smooth muscle cells showed a decrease in respiration and oxygen affinity after hypoxic incubation. This may affect proliferation and vascular remodeling in conditions of chronic hypoxia