Identifizierung und Charakterisierung differentiell exprimierter Gene während der Hyphenbildung in Malassezia furfur mittels cDNA- Subtraktionsverfahren

Malassezia-Hefen sind die Erreger der Pityriasis versicolor, einer der häufigsten oberflächlichen Hautpilzerkrankungen des Menschen. Als mögliche Auslöser dieser Erkrankung werden in den gemäßigten Breiten Malassezia globosa und Malassezia furfur vermehrt in den tropischen Klimazonen diskutiert. Die Diagnose der Pityriasis versicolor wird vorwiegend klinisch gestellt. Entscheidend für die Diagnose ist allerdings das Auftreten von klumpenartigen Zellhaufen und kurzen, dicken Hyphen im mikroskopischen Bild des Nativpräparates aus Schuppen befallener Hautbezirke. Da das Vorkommen von Hefezellen und Hyphen auf befallener Haut zu 100%, auf gesunder Haut allerdings nur zu 6-7% geprägt ist, nimmt man an, dass die Hyphenbildung mit der Pathogenese der PV einhergeht und somit einen wichtigen Pathogenitätsfaktor darstellt. Die Pathogenese der PV und der Zusammenhang zur Hyphenbildung konnte bis heute noch nicht aufgeklärt werden. Auch über das Genom von Malassezia furfur ist nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit war es möglich, Malassezia-Hefen auf einem Minimalmedium aus Agar, einer Lipid- und einer Stickstoffquelle wachsen zu lassen. Speziell für Kulturen von Malassezia furfur ließen sich mit Glycin als alleiniger Stickstoffquelle sowohl auf festem, wie auch in flüssigem 1b-Minimalnährmedium Hyphen induzieren. In flüssigem Nährmedium spielte hierbei das Verhältnis zwischen Flüssigkultur und der über dem Medium befindlichen Luftsäule eine große Rolle. Weiterhin wurde versucht, auch auf molekularbiologischer Ebene einen tieferen Einblick in die Hyphenbildung zu bekommen. Dies gelang mit dem cDNA-Subtraktionsverfahren, das ohne Kenntnis des Genoms eines Organismus auskommt und mit dem gleichzeitig die genetische Regulation der Hyphenbildung genauer untersucht werden konnte. Die erhaltenen Sequenzen wurden im reversen Northern-Blot auf ihre differentielle Expression gescreent. Die differentiell exprimierten Sequenzen wurden daraufhin sequenziert und mittels translated vs. Translated-blast-Suche (tblastx) mit der NCBI-Gendatenbank und der MIPS Ustilgo maydis-Gendatenbank abgeglichen. 83 Sequenzen von 991 Klonen der 6 Stunden-Hypheninduktionskultur konnten erfolgreich sequenziert werden. Vier der differentiell exprimierten Sequenzen konnten durch Literaturabgleich mit der Hyphenbildung bei Ustilago maydis näher in Verbindung gebracht werden. Diese Sequenzen zeigen Homologien zu einer PEP4-Aspartyl-Protease, einem GCY1-Gen, einem Iron-Sulfur-Scraffold-like-Protein und einem Protein mit bislang noch unbekannter Funktion. Dies weist darauf hin, dass diese Gene auch bei der Hyphenbildung von Malassezia-Hefen eine Rolle spielen könnten. Zur Abklärung ihrer Bedeutung sind in diesem Zusammenhang allerdings weitere Untersuchungen erforderlich. Mit dieser Arbeit konnte ein erster Einblick in die genetische Regulation der Hyphenbildung bei Malassezia furfur auf molekularbiologischer Ebene geleistet werden. Das Ziel weiterer Arbeiten muss sein, die Expression der identifizierten Sequenzen in Läsionen der PV mittels RT-PCR weiter zu untersuchen. Auf diese Weise kann die Rolle der Hyphenbildung in der Pathogenese der PV weiter aufgeklärt werden.Malassezia-yeasts are the causative agents of the Pityriasis versicolor, one of the most widespread superficial dermatoses of the human being. Up to now the exact cause of the disease has not yet been definitely clarified. As possible causes of this disease Malassezia globosa found in the temperate parts of the world and Malassezia furfur found in the tropical climatic zones are brought to discussion with increasing frequency. The diagnosis of Pityriasis versicolor mainly is made clinically. Finally decisive for the diagnosis is the occurrence of lump-like cell heaps and short, thick hyphae (“Spaghetti and meatballs”) in the microscopical picture of the native slide preparation consisting of scales of skin districts attacked. According to yeast cells and hyphae occurring per 100% on attacked skin and per 6-7% only on healthy skin, it is assumed that the formation of hyphae is an important factor in the still unknown pathogenesis of PV. Very little also is described so far about the genome of Malassezia furfur. Growth of Malassezia-yeasts was made possible on an 1b-minimal medium containing agar-agar, as well as a lipid- and a nitrogen source. In particular Malassezia furfur strains could be cultivated under induction of hyphal growth when using glycine as sole nitrogen source on solid and liquid minimal medium. In liquid cultures the hyphal growth amount obviously depended on the relation between the broth and the extent of air above the minimal medium. Furthermore, to gain a deeper insight into the formation of hyphae on a molecular-biological level c-DNA-substraction-analasis was performed by which informations about the genetic regulation of the process of hyphal formation can be achieved without knowledge of the genome of an organism. Sequences received were screened in the reverse-northern-blot-analysis with regard to their differential expression. The sequences expressed differentially were sequenced and by translated vs. translated-blast-search (tblastx) compared to the NCBI-data base of genes as well as the MIPS Ustilago maydis data base of genes. 83 sequences out of 991 clones from the 6-hours-culture of hyphal induction could successfully be sequenced. Four of the sequences expressed differentially could be brought in connection with the forming of hyphae by Ustilago maydis, an organism close to Malassezia-yeasts. These sequences show homologies as to a PEP4-Aspartyl-Protease, a GCY1-gene, an Iron-Sulfur-scraffold-like-Protein and a protein whose function so far is not yet known. This points out that these gene sequences could play a role in the forming of hyphae by Malassezia-yeasts as well. In order to clarify their significances in this connection, further studies are necessary. According to these results a first insight in the genetic regulation of the forming of hyphae by Malassezia furfur could be given on the molecular-biological level. A long-term goal of these studies would be to further investigate the expression of sequences identified in lesions of PV by use of RT-PCR. This could give more clarification about meaning of the formation of hyphae in the pathogenesis of PV