Einfluss alveolär rekrutierter Exsudatmakrophagen auf die LPS-induzierte pulmonale Inflammation in vivo

Die pulmonale Entzündungsantwort im Rahmen einer Pneumonie ist einerseits essenziell für die Elimination von Pathogenen. Andererseits können Entzündungsvorgänge im hochsensiblen Lungenparenchym durch Gewebsschädigung die pulmonale Schrankenfunktion und den Gasaustausch schwerwiegend beeinträchtigen, bis hin zum akuten respiratorischen Distress Syndrom (ARDS). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von Exsudatmakrophagen, die im Verlauf der Inflammation neben neutrophilen Granulozyten durch Interaktion des Monozyten-rekrutierenden Chemokins CCL2 (MCP-1) mit seinem monozytär exprimierten Rezeptor CCR2 in den Alveolarraum rekrutiert werden, in der frühen und späten Entzündungsphase zu untersuchen. Hierzu wurde die durch intratracheale Instillation von LPS in verschiedener Dosierung in C57BL/6 Mäusen ausgelöste pulmonale Inflammation hinsichtlich des zellulären Entzündungsprofils (Differentialzytologie der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit, Lungenhistologie) und der pulmonalen Schrankenfunktion (Übertritt von FITC-Albumin aus der Gefäßbahn in den Alveolarraum) untersucht. In Wildtyptieren wurde der Entzündungsverlauf durch sequentielle Analysen über einen Zeitraum von 120 Stunden charakterisiert, welcher sowohl die Initierung als auch die Terminierung der Entzündungsreaktion umfasste. Um die Rolle CCL2/CCR2-abhängig rekrutierter Exsudatmakrophagen für den durch Instillation von 50µg LPS induzierten Entzündungsverlauf zu definieren, wurde das zelluläre Entzündungsprofil in der bronchoalveolären Lavage und Lungenhistologie in Wildtyp Tieren und CCR2-defizienten Mäusen verglichen. Im Gegensatz zu Wildtyp Tieren zeigten CCR2-defiziente Mäuse wie erwartet nach Behandlung mit 50µg LPS nahezu keine alveoläre Rekrutierung von Exsudatmakrophagen. Interessanterweise waren in diesen Tieren hingegen die alveoläre Neutrophilenrekrutierung und die Entzündungsreaktion in der Lungenhistologie deutlich verstärkt und verlängert nachweisbar. Auch die pulmonale Schrankenstörung, gemessen als kapillo-alveolärer Übertritt von FITC-Albumin, war ausgeprägter und hielt länger an. Die Befunde sprechen für eine bislang unbekannte Entzündungs-attenuierende Funktion der CCL2/CCR2 Achse und der CCR2-abhängig rekrutierten Exsudatmakrophagen im Modell der LPS-induzierten pulmonalen Inflammation. Die verstärke Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in CCR2-defizienten Tieren war nicht auf die erhöhte alveoläre Freisetzung der Neutrophilen-rekrutierenden-Chemokine MIP-2 und KC zurückzuführen, da die quantitative Bestimmung dieser Zytokine in der BALF mittels ELISA keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp-Mäusen und CCR2-defizienten Mäusen ergab. Um die Rolle von Exsudatmakrophagen, die Fraktakine/Fraktalkine-Rezeptor vermittet pulmonal rekrutiert werden, zu untersuchen, wurden Fraktalkine-Rezeptor defiziente Mäuse mit Wildtyp- und CCR2-defizienten Tieren verglichen. Im Gegensatz zu CCR2-defizienten Tieren zeigten Fraktalkine-Rezeptor defiziente Mäuse keine verstärkte pulmonale Inflammation nach intratrachealer LPS-Gabe, sondern einen mit Wildtyp-Mäusen vergleichbaren Entzündungsverlauf. Somit ließ sich kein Entzündungs-modulierenden Effekt der Fraktalkine/Fraktalkine-Rezeptor Achse im verwendeten LPS-Modell nachweisen. Um zu klären, ob der auf zirkulierenden Monozyten oder der auf residenten Alveolarmakrophagen exprimierte CCR2 für den Entzündungs-hemmenden Effekt im LPS Modell verantwortlich war, wurden Untersuchungen an chimären Wildtyp-Mäusen durchgeführt, denen nach letaler Bestrahlung CCR2-defizientes Spenderknochennmark transplantiert wurde. Bei diesen Tieren sind zwei Wochen nach Knochenmarkstransplantation die zirkulierenden Blutzellen durch CCR2-defiziente Spenderzellen ersetzt, während die residenten Alveolarmakrophagen noch einen CCR2-exprimierenden Empfängerphänotyp aufweisen. Diese chimären Wildtyp-Mäuse zeigten trotz intakter CCR2-Expression auf residenten Alveolarmakrophagen die gleiche verstärkte pulmonale Entzündungsreaktion wie CCR2-defiziente Mäuse mit fehlender CCR2-Expression auf residenten Alveolarmakrophagen. Somit ist für den Entzündungs-hemmenden Effekt im LPS-Modell nicht die Expression von CCR2 auf residenten Alveolarmakrophagen, sondern die CCR2 Expression auf zirkulierenden Zellen notwendig. Dies wurde durch Transfusionsexperimente von mononukleären peripheren Blutzellen mit intakter oder fehlender CCR2-Expression in CCR2-defiziente Tiere bestätigt. CCR2-defiziente Tiere, die CCR2-exprimierende Wildtyp Leukozyten erhielten, zeigten eine reduzierte und verkürzte pulmonale Inflammation, welche dem Verlauf in Wildtyp-Mäuse entsprach. Um potentielle Mediatoren zu identifizieren, die den beobachteten anti-inflammatorischen Effekt von CCR2-abhängig rekrutierten Exsudatmakrophagen vermitteln, wurde die Genexpression ausgewählter Zytokine in FACS-separierten Blut Monozyten und Exsudatmakrophagen aus der bronchoalveolären Lavage verglichen, wobei transgene CX3CR1+/GFP-Tiere mit endogener Fluoreszenzmarkierung mononukleärer Phagozyten für die hochreine Isolation dieser Zellen genutzt wurden. Exsudatmakrophagen zeigten sehr viel höhere mRNA Spiegel des Zytokins IL1-RA als zirkulierende Monozyten. Dieser endogene Antagonist von IL1 ist somit ein potentielles Mediatormolekül, über welches CCR2-abhängig rekrutierte Exsudatmakrophagen ihre anti-inflammatorischen Effekte im untersuchten LPS-Modell vermitteln könnten.The lung inflammatory response is essential for pathogen clearance but may also induce lung tissue damage which severely affects lung barrier function and gas exchange which may lead to acute respiratory distress syndrome (ARDS). Central aim of the presented work was to define the role of exudate macrophages recruited to lung tissue by interaction of CCL2 with its receptor CCR2 during the early and late inflammation phase. Therefore the inflammatory response induced by intratracheal LPS application in C57BL/6 mice was analysed for inflammatory profiles (BALF cytospins, lung histology) and lung barrier function (FITC albumin leakage) sequentially for a 120h period which covered both inflammation initiation and terminantion. To define the role of CCL2/CCR2-dependently recruited exudate macrophages for the inflammatory response induced by instillation of 50 µg LPS cellular BALF profiles and lung histologies in wildtype and CCR2-deficient mice largly lacking lung monocyte recruitment were compared. Strikingly, neutrophil recruitment to the alveolar space, inflammation in lung tissue evaluated by histology and lung barrier dysfunction analysed by FITC albumin leakage were heavily increased and prolonged in CCR2-deficient mice suggesting an attenuating role for CCL2/CCR2 dependend exudate macrophage recruitment during lung inflammation. The increased neutrophil recruitment observed in CCR2-deficient mice was not due to increased alveolar release of the neutrophil attracting chemokines MIP-2 and KC because quantification of these cytokines in BALF by ELISA revealed no differences between wildtype and CCR2-deficient mice. In contrast to CCR2-deficient mice fractalkine-receptor deficient animals showed no increase in lung inflammation but displayed an inflammatory response comparable to wildtype mice indicating that fractalkine receptor depently recruited exudate macrophages have no inflammation modulating effect in this model of LPS induced lung injury. To assess whether CCR2 expressed on circulating monocytes or on resident alveolar macrophages is critical for inflammation attenuation in the LPS model bone marrow chimeras were generated by transplanting CCR2-deficient donor bone marrow into lethally irradiated wildtype recipients. In these chimeric mice, circulating blood cells are replaced by CCR2-deficient donor cells two weeks after transplantation whereas resident alveolar macrophages are still of recipient phenotype expressing intact CCR2. Like CCR2-deficient mice these chimeric aminals showed severely increased lung inflammation despite intact CCR2-expression on resident alveolar macrophages indicating that monocyte expressed CCR2 is essential for attenuating lung inflammation. This was confirmed by transfusion of mononuclear blood cells with intact or lacking CCR2-expression into CCR2-deficient mice. Transfusion of CCR2-expressing wildtype blood cells completely attenuated exaggerated lung inflammation in CCR2 deficient animals to wildtype levels. To identify potential mediators for the observed anti-inflammtory effects of CCR2-dependently alveolar recruited exudate macrophages gene expression of selected cytokines in FACS separated blood monocytes and BALF exudate macrophages were compared by real time RT-PCR. Since gene expression of IL1-ra was drastically increased in exudate macrophages this endogenous antagonist of IL1 could be indentified as a candidate molecule which might exert the anti-inflammatory effects of CCR2-dependently recruited exudate macrophages in LPS-induced lung injury