Untersuchungen der Blut-Hoden-Schranke während der Rekrudeszenz der Spermatogenese nach Downregulation mittels eines slow release GnRH-Implantates beim Rüden : Expression von Connexin 43, Occludin, Claudin-3, -5 und -11

Die Integrität der Blut-Hoden-Schranke (BTB), als wichtiger Faktor für den reibungslosen Ablauf der Spermatogenese, ist in der Literatur bereits eindeutig beschrieben. Dabei teilt die BTB das Keimepithel der Tubuli seminiferi in ein basales und ein adluminales Kompartiment und gewährleistet damit den Schutz der primären Spermatozyten und haploiden Spermatiden vor potenziell schädlichen Substanzen durch eine Passagebehinderung von Molekülen aus dem Interstitium in das adluminale Kompartiment. Einen maßgeblichen Anteil am Aufbau der BTB haben Tight- und Gap-Junctions, welche wiederum aus verschiedenen integralen Membranproteinen lokalisiert zwischen benachbarten Sertoli-Zellen aufgebaut sind. Wie bereits in verschiedenen Spezies nachgewiesen sind besonders das Gap- Junction Protein Connexin (Cx) 43 sowie die Tight-Junction Proteine Occludin (OCLN), Claudin (CLDN) -3, -5 und -11 an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion beteiligt. Ziel dieser Arbeit war es, die Entwicklung der BTB im Verlauf der Rekrudeszenz der Spermatogenese durch die Untersuchungen von Cx43, OCLN, CLDN-3, -5, und -11 auf mRNA-Ebene sowie Cx43 ebenfalls auf Protein-Ebene zu charakterisieren. Hierbei wurde das Modell der Downregulation mittels eines slow release GnRHImplantates genutzt, um einen Arrest der Spermatogenese auf Ebene der Spermatogonien bzw. Spermatozyten zu induzieren. Die gewonnenen Daten sollten mit der Situation am juvenilen bzw. am adulten, unbehandelten Hoden verglichen werden. 23 Beagle-Rüden wurden mit einem slow release GnRH-Implant (Gonazon ®, 18,5 mg Azagly-Nafarelin) behandelt, welches nach 5 Monaten nach Downregulation der endokrinen und germinativen Hodenfunktion entfernt wurde. Jeweils 3-4 Rüden wurden im Intervall von 3 Wochen (Wo0-24) chirurgisch kastriert. Die Einteilung der Hunde erfolgte zum einen nach dem Zeitpunkt der Kastration (Wo-0, -3, -6, -9, -12 und 24) und zum anderen nach histologischen Charakteristika, d.h. den am weitesten entwickelten Keimzellen („developental groups“: DG A (Spermatozyten), DG B (runde Spermatiden), DG C (elongierende Spermatiden) und DG D (elongierte Spermatiden)). Um den Effekt unterschiedlicher GnRH-Agonist Implantate zu untersuchen, wurden konform mit Woche 0 zudem je 3 Hunde mit Suprelorin®, (4,7 mg Deslorelin) bzw. Profact® Depot (6,3 mg Buserelinacetat) behandelt und ebenfalls nach 5 Monaten während des Status der Downregulation chirurgisch kastriert. Als Kontrollgruppen diente das Hodengewebe von 5 adulten und 3 juvenilen Rüden. Auf mRNA-Ebene gelang der Nachweis der Expression für die 5 untersuchten Gene (Cx43, OCLN, CLDN-3, -5 und -11) in allen untersuchten Gruppen mittels RT-PCR und qPCR. Sowohl Cx43 als auch CLDN-11 zeigten in der Wochengruppe (Wo) 3 signifikant höhere Werte als in der Wo12, sowie Cx43 ebenso zu Wo24. Für OCLN zeigten sich sowohl im Wochengruppenvergleich eine signifikant geringere Expression in Wo0 und Wo3 verglichen mit Wo6, als auch im DG-Vergleich für DG A verglichen mit DG C, DG D und CG sowie für DG B im Vergleich zu DG D. CLDN-3 und -5 zeigten im Wochengruppenvergleich die stärkste Genexpression in Wo0, was sich für CLDN-5 ebenfalls im DG-Vergleich bestätigen ließ. Für Cx43 erfolgte zusätzlich der Nachweis auf Proteinebene, wobei die Immunhistochemie eine spezifische Färbung zwischen Sertoli-Zellen und zwischen Sertoli-Zellen und basal gelegenen Keimzellen ergab. Im Verlauf der Rekrudeszenz der Spermatogenese kam es zu einer Verlagerung des Signals aus dem adluminalen in das basale Kompartiment. In DG C und DG D sowie in den Wo6, -9, -12 und -24 zeigte sich wie in CG ein charakteristisches immunhistochemisches Bild mit einer immunopositiven Reaktion zirkulär oberhalb der Spermatogonien und unterhalb der primäre Spermatozyten. Die Expression der untersuchten Proteine weist sowohl auf mRNA als auch auf Protein-Ebene auf eine Veränderung bzw. einen Zerfall der BTB im Verlauf der Downregulation hin. In Bezug auf die gewonnenen Ergebnisse scheint eine schnelle Wiederherstellung der BTB gegeben und es zeigt sich nach vollständiger Rekrudeszenz der Spermatogenese (Wo12, -24) für alle Proteine auf mRNA- und für Cx43 auch auf Proteinebene kein signifikanter Unterschied zu den unbehandelten Kontrollgruppen. Die gewonnenen Ergebnisse weisen eindeutig auf die Funktion von Cx43, OCLN, CLDN-3, -5 und -11 für die BTB beim Hund hin. Während sich durch die Downregulation signifikante Veränderungen der Proteine im Bereich der BTB ergeben, belegen die vorliegenden Daten, dass nach erfolgter Rekrudeszenz der Ausgangszustand der ungestörten Spermatogenese mit intakter BTB wiederhergestellt wird, sodass die durch die Anwendung eines slow release GnRHAgonist- Implantates induzierten Effekte nicht nur auf Ebene der Steroidogenese und anhand der morphologischen Charakteristika, sondern auch auf Ebene der BTB als vollständig reversibel angesehen werden könnenThe integrity of the blood-testis-barrier (BTB) as a major factor for spermatogenesis has already been adressed in literature. The BTB separates the germinal epithelium into a basal and an adluminal compartment and protects primary spermatocytes and haploid spermatids against potentially hazardous substances by inhibiting transportation of certain molecules from the interstitium into the adluminal compartment. Tight- and Gap-Junctions consisting of various integral membrane proteins between adjacent sertoli cells are the major component of the BTB. The Gap-Junction protein Connexin (Cx) 43 as well as the Tight-Junction proteins Occludin (OCLN), Claudin (CLDN) -3, -5 and -11 are predominantly involved in the barrier function. Aim of the present study was to characterise the mRNA.expression of Cx43, OCLN, CLDN-3, -5, and -11 and protein expression of Cx43 on the development of the BTB during recrudescence of spermatogenesis. The model of the downregulated testis was used to induce an arrest of spermatogenesis on the level of spermatogonia and primary spermatocytes. The results obtained should be compared with the juvenile and the adult canine testis. 23 male Beagle were treated with a slow release GnRH-implant (Gonazon®, 18.5 mg Azagly-Nafarelin) which was removed after five months following downregulation of the endocrine and germinative testicular function. Three to four dogs each were castrated at 3-week intervals (week 0-24). Grouping of dogs was according to the time of castration (week 0, 3, 6, 9, 12 and 24), but also according to histological criteria (the most developed germ cell observed) (developmental groups: DG A, spermatocytes; DG B, round spermatids; DG C, elongating spermatids and DG D, elongated spermatids). To test for the influence of the GnRH-agonist implant 3 dogs each were treated with a Suprelorin® (4.7 mg Deslorelin) or Profact® Depot (6.3 mg busereline acetate) implant and castrated after 5 months during downregulation. Five adult and 3 juvenile male dogs served as controls. The 5 investigated genes (Cx43, OCLN, CLDN-3, -5 und -11) were proven in all groups using RT-PCR and RT-qPCR. mRNA expression of Cx43 and CLDN-11 was significantly higher in week (w) 3 compared to w12 and w24 (the latter Cx43 only). OCLN expression was significantly lower in w0 and -3 compared to w6; besides it was lower in DG A compared to DG C, DG D and CG as well as for DG B compared to DG D. For CLDN-3 and -5, gene expression was highest in w0 and DG A (CLDN- 5). Cx 43 was also investigated on the protein level with a specific staining being observed in immunohistochemistry between sertoli cells and sertoli cells and basal germ cells. During recrudescence of spermatogenesis, the immunopositive signal was relocated from the adluminal to the basal compartment. In DG C and -D, w6, -9, -12 and -24 as well as CG the characteristic staining pattern with a staining circular above the spermatogonia and below the primary spermatocytes was detected. Western Blot was used to verify specificity of the antibody. The expression of the investigated genes on the mRNA and protein level points to a disintegration of the BTB during downregulation. Reorganisation of the BTB occurs rapidly with no significant difference being detected following recrudescence (w12, w24) compared to the untreated adult controls. The results obtained underline the function of Cx 43, OCLN, CLDN-3, 5 and 11 for the BTB in the dog. Significant changes occur during downregulation. Following recrudescence, spermatogenesis including the BTB recovered completely leading to the conclusion that the effects induced by treatment with a slow release GnRH-agonist implant are fully reversible – not only regarding steroidogenesis and morphological characteristics as shown before- but also regarding the BTB