Induction of apoptosis by the indoloderivate malassezin to two melanoma cell lines

Das maligne Melanom wurde erstmals um 1806 von Rene Laennec beschrieben. Die Inzidenz des malignen Melanoms ist im Steigen. Sobald ein malignes Melanom Fernmetastasten gesetzt hat, ist die Behandlung äußerst schwierig. Meist sind nur noch palliative Therapieansätze möglich. In jüngster Zeit treten zunehmend Melanome auf, deren zugrunde liegende Zellreihe bereits gegen Chemotherapeutika resistent geworden ist. Dies hat fatale Folgen für die betroffenen Patienten. In dieser Arbeit wurde der Einfluß des Indolderviats Malassezin, das aus dem Hefepilz Malassezia furfur als Sekundärmetabolit isoliert werden konnte, auf die beiden Melanom-Zellreihen MeWo und WM115 untersucht. Besonderes Augenmerk wurde auf die mögliche Apoptose-Induktion durch das Malassezin gesetzt. Durch Krämer et al. 2003 konnte bereits ein apoptotischer Einfluß des Malassezins auf humane Melanozyten bestätigt werden. Lichtmikroskopisch konnte bei hohen Konzentrationen erhebliche morphologische Veränderungen beobachtet werden. Statt des natürlichen Aussehens beider Zellreihen waren in der höchsten Konzentration abgerundete, losgelöste Zellen zu erkennen. Erst bei niedrigen Konzentrationen wurde der Einfluß geringer. Um die Zellveränderungen zu spezifizieren, wurde zwischen Apoptose und Nekrose mittels Facs differenziert. Die Zellen wurden unter Verwendung von Annexin V FITC angefärbt, das als Apoptose-spezifischer Marker gilt. Zur Abgrenzung zu nekrotischen Zellen wurde den isolierten Zellen zusätzlich 7-AAD zugegeben. Es wurde eine dosisabhängige Apoptose detektiert. Als Kontrolle wurde begleitend ein LDH-Test durchgeführt. Da es sich um Apoptose handelt, ist das zytoplasmatische Enzym LDH, das durch den Untergang der Zelle bei Nekrose freigesetzt wird, konstant niedrig geblieben. Um diese Befunde weiter zu charakterisieren, wurde aufgereinigte RNA in cDNA umgewandelt. Diese wurde mit SYBR Green Master Mix auf einen RT-PCR Array (RT2-ProfilerTM PCR Array System, SuperArray) gegeben, der 84 Apoptose-spezifische Gene enthält. Mittels RT-PCR wurde die Regulation der interessierenden Gene detektiert. Es waren deutliche Unterschiede zwischen beiden Zellreihen sichtbar. Bei MeWo beginnt schon bei niedriger Konzentration und kurzer Inkubationszeit die Apoptose, die sich nach langer Inkubationszeit bei gleicher Konzentration verstärkt. Es ist ein Zusammenspiel von extrinsischem und intrinsischem Apoptose Signalweg zu erkennen. Demgegenüber ist die Zellreihe WM115 resistenter gegenüber dem Malassezin-Einfluß. Trotz langer Inkubationszeit und zwei unterschiedlichen Konzentrationen wird die Apoptose hauptsächlich durch Down-Regulation von Anti-Apoptose Genen reguliert. Aufgrund der Hochregulation der Caspasegene kann vemutet werden, dass die hier ablaufende Apoptose auf mitochondriale Dysfunktion beruht. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Malassezin selektiv auf bestimmte Zellreihen wirkt. Wahrscheinlich spielt die Interaktion mit dem AH-Rezeptor dabei eine große Rolle. Auf welche Zellreihen das Malassezin den größten Einfluß hat und ob dieser auch bei Sublinien zu finden ist, die bereits durch Resistenz gegenüber diversen Chemotherapeutika auffallen und somit die Fähigkeit zur Apoptose verloren haben, ist weiteren Untersuchungen vorbehalten.The malignant melanoma has been first described around 1806 by Rene Laennec. The malignant melanoma incidence is increasing. As soon as the malignant melanoma has metastasis, its treatment is extremely difficult. Then in most cases there are only palliative therapies possible. Recently there are more and more melanoma, the cell lines on which theyre based on, have got resistant against chemotherapies already. This is a fatal result for the concerning patients. The present study has analysed the influence of the Indolderivate Malassezin, which was isolated from the yeast Malassezia furfur as a secondary metabolite, to the two melanoma cell-lines MeWo and WM115. Special focus was based on the possible apoptosis-induction of Malassezin. Krämer et al. 2003 had already confirmed the apoptotic influence of Malassezin to human melanocytes. In light-microscopy relevant morphological changes were noticed at high concentrations. Instead of the natural looking of both cell-lines, we recognized well-rounded and isolated cells in the highest concentrations. Not until lower concentrations they returned to a normal image. To specify the cell alterations we distinguished between apoptosis and necrosis with FacScan. The cells were labelled under the use of Annexin V FITC which is well-known as an apoptosis-specific marker. To distinguish to necrotic cells the isolated cells were also marked with 7-AAD. We detected a dose-dependent apoptosis. As a control we accompanied the experiments with a LDH-test. So far it is apoptosis, the cytoplasmatic enzyme LDH, which released by cells undergoing necrosis, was consistently at low levels. To specify these findings, purified RNA were converted into cDNA. Together with SYBR Green Master Mix the cDNA were given onto an RT-PCR Array (RT2-ProfilerTM PCR Array System, SuperArray) containing 84 apoptosis-specific genes. Via RT-PCR the regulation of the interesting genes were detected. There were noticeable differences between the two cell-lines. MeWo started apoptosis at lower concentration and shorter incubation times which increased after long periods of incubations while the concentration was the same. Its making out an interplay between the extrinsic and intrinsic apoptotic pathway. Compared with this the cell-line WM115 is much more resistant to the Malassezin-influence. Despite long incubation-periods and two different concentration-dosis, it seems that apoptosis is mainly regulated by down-regulation of anti-apoptotic genes. This assumes that apoptosis could run through mitochondrial dysfunction. These results conclude that Malassezin has a selective effect to certain cell-lines. Probably the interaction with the AH-receptor plays an important role. To which cell-line Malassezin has the most influence, and if this influence could also be find in sub-lines which are conspicuous to be resistant to chemotherapies, and if they loose their capability undergoing apoptosis is still unclear. This is to be cleared in further experiments