Biochemische Untersuchungen an Seminalplasma von Rüden unter Berücksichtigung der Fertilitätsparameter

Die Ejakulatuntersuchung ist seit vielen Jahren ein fester Bestandteil der assistierten Reproduktionsmedizin beim Haushund und wird insbesondere zur Überprüfung der Fertilität in Betracht gezogen. Diverse Forschungsarbeiten konnten belegen, dass die biochemische Zusammensetzung des Seminalplasmas einen entscheidenden Einfluss auf die Fertilität besitzt. Dennoch wird diese Komponente des Ejakulats im Rahmen einer Fertilitätskontrolle kaum beachtet. In der Literatur gibt es nur einzelne Hinweise über die Enzymaktivitäten und Konzentrationen an Mengen- und Spurenelementen im caninen Seminalplasma bei Normo- oder Pathospermie. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Aktivitäten der verschiedenen Enzyme und Konzentrationen an Mengen- und Spurenelemente in den einzelnen drei Ejakulatfraktionen des Seminalplasmas zu bestimmen. Des Weiteren sollte untersucht werden, inwieweit sich signifikante Unterschiede in Ejakulaten mit Normo- oder Pathospermie ergeben. Hierzu standen insgesamt Ejakulate von 50 Rüden unterschiedlicher Rassen mit einem Lebensalter von ein bis zehn Jahren zur Verfügung. Aufgrund der Ejakulatbeschaffenheit wurden die Probanden in zwei Gruppen eingeteilt. Die Gruppe Normospermie bestand aus 20 Tieren, in der Gruppe Pathospermie befanden sich 30 Tiere. Da die Gewinnung der Proben über einen längeren Zeitraum erfolgte, wurde das Seminalplasma bei einer Temperatur von -20 °C tiefgefroren. So war es ein weiteres Ziel der eigenen Studie, die Auswirkungen des Tiefgefrierprozesses auf die Enzymaktivitäten im caninen Seminalplasma zu überprüfen. Dazu standen insgesamt Proben von 16 Rüden zur Verfügung, die jeweils am 0., 1., 7. und 30. Tag getrennt nach den einzelnen drei Ejakulatfraktionen ausgewertet wurden, wobei die Probe von Tag 0 nicht eingefroren wurde. Die Gewinnung der Proben erfolgte mittels manueller Stimulation. Im Anschluss wurde eine grobsinnliche Prüfung des Ejakulates durchgeführt und das Seminalplasma durch Zentrifugation des Samens gewonnen. In Bezug auf die biochemische Zusammensetzung des Seminalplasmas wurden die Enzymaktivitäten der Alkalischen Phosphatase, Sauren Phosphatase, nicht-prostataspezifischen Sauren Phosphatase, Aspartat-Amino-Transferase, Gamma-Glutamyl-Transferase und Laktatdehydrogenase sowie die Konzentrationen der Mengenelemente Natrium, Kalium, Calcium (gesamt), Magnesium und anorganisches Phosphat sowie die Spurenelemente Zink (gesamt), Kupfer (gesamt) und Eisen (gesamt) ermittelt. Die photometrische Bestimmung von Magnesium, anorganischem Phosphat, Kupfer, Zink und Eisen sowie die Bestimmung der Enzymaktivitäten erfolgte mittels Spektralphotometrie. Mittels Flammenphotometrie wurden die Mengenelemente Natrium, Kalium und Calcium bestimmt. Die Ergebnisse der Enzymaktivitäten zeigen im Vorversuch statistisch signifikante Unterschiede zwischen dem Tag 0 und dem Tag 30. Jedoch dokumentierten sämtliche Enzyme an Tag 0 verglichen mit Tag 1 nur minimale Verringerungen in der Aktivität. So lässt der vorliegende Versuch darauf schließen, dass die Methode des Einfrier- und Auftauprozesses bei der Interpretation der Ergebnisse des Hauptversuches berücksichtigt werden muss, allerdings die Beeinflussung nur geringgradige Auswirkungen auf die Ergebnisse besitzt. Folgende relevanten Ergebnisse konnten im Hauptversuch erhoben werden: • Die Alkalische Phosphatase, Aspartat-Amino-Transferase, Gamma-Glutamyl-Transferase und Laktatdehydrogenase zeigten in der 2. Fraktion die höchsten Aktivitäten. • Die Saure Phosphatase und die nicht-prostataspezifische Saure Phosphatase wiesen in den Fraktionen 2 und 3 vergleichbare Aktivitäten auf. • Das Mengenelement Natrium zeigte in der zweiten Fraktion die niedrigste Aktivität • Die Konzentrationen von Kalium, Calcium und Kupfer waren in der 2. und 3. Fraktion vergleichbar. • Die Magnesiumkonzentration war in der 3. Fraktion am höchsten. • Die Phosphatkonzentrationen zeigten im Vergleich der drei Ejakulatfraktionen höhere Werte in der 2. Fraktion. • Im Gruppenvergleich Normo- und Pathospermie konnten statistisch signifikante Unterschiede (p = 0,036) in der 1. Fraktion bezüglich der Gesamtcalciumkonzentrationen dokumentiert werden. Die Gruppe Pathospermie verzeichnete niedrigere Konzentrationen. • Im Gruppenvergleich Normo- und Pathospermie konnten statistisch signifikante Unterschiede der Kupferkonzentrationen in der 2. Fraktion (p = 0,001) und in der 3. Fraktion (p = 0,027) dokumentiert werden. Die Gruppe Pathospermie verzeichnete höhere Konzentrationen. • Im Gruppenvergleich Normo- und Pathospermie konnten statistisch signifikante Unterschiede der Enzymaktivität der Alkalischen Phosphatase (p = 0,045) in der 3. Fraktion dokumentiert werden. Die Gruppe Pathospermie verzeichnete niedrigere Aktivitäten. • Im Gruppenvergleich Normo- und Pathospermie konnten in der 3. Fraktion statistisch signifikante Unterschiede (p = 0,002) in der Kaliumkonzentrationen dokumentiert werden. Die Gruppe Pathospermie wies niedrigere Werte auf. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen differierende Aktivitäten und Konzentrationen der Enzyme und Mengen- und Spurenelemente in den einzelnen drei Fraktionen. So kann auf eine unterschiedliche Beteiligung der Genitalorgane an der Freisetzung der untersuchten Parameter geschlossen werden. Ob es rassespezifische und altersspezifische Unterschiede in der Zusammensetzung des caninen Seminalplasmas gibt, sollte Ziel zukünftiger Untersuchungen sein. Des Weiteren konnten die vorliegenden Ergebnisse signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen Normo- und Pathospermie hinsichtlich der Konzentrationen von Kupfer, Kalium, Calcium und der Aktivitäten der Alkalischen Phosphatase dokumentieren. So können Abweichungen der biochemischen Zusammensetzung des Seminalplasmas im Zusammenhang mit Störungen oder Erkrankungen der akzessorischen Geschlechtsdrüsen und damit ursächlich zu Beeinträchtigungen der Fertilität im Zusammenhang stehen.Semen analysis is an integral part of assisted reproduction in the dog and is used for examination of fertility. Several publications verified that biochemical components of the seminal plasma have an important influence on fertility. However, these biochemical parameters are usually not assessed in case of fertility control. Little information has so far been published on enzyme activities and concentrations of macro- and microelements in the canine seminal plasma in case of normospermia or pathospermia. The aim of the present thesis was to determine activities of the different enzymes and concentrations of macro- and microelements in the seminal plasma of the three ejaculate fractions of the dog. Furthermore, the aim was to determine whether significant differences exist between ejaculates with normo- or pathospermia. Ejaculates of 50 different dogs of different breeds aged 1-10 years were examined. The ejaculates were grouped according to semen quality: The group normospermia consisted of 20 dogs, the group pathospermia of 30 males. As samples were obtained during a longer period of time, the seminal plasma was frozen at -20 °C. Another aim of this study was to assess the influence of freezing on the activities of enzymes present in the canine seminal plasma. Therefore, seminal plasma samples obtained from 16 males were examined on day 0, 1, 7 and 30, differentiating the three ejaculate fractions. Samples of day 0 were not frozen. Semen samples were obtained by manual masturbation. The ejaculates were examined and the seminal plasma was obtained by centrifugation of semen. The following parameters were examined in the seminal plasma: the enzyme activities of Alkaline Phosphatase, Acid Phosphatase, non-prostate specific Acid Phosphatase, Aspartate-Amino-Transferase, Gamma-Glutamyl-Transferase, Lactate Dehydrogenase as well as the concentrations of sodium, potassium, calcium (total), magnesium and inorganic phosphate, the trace elements zinc (total), copper (total) and iron (total). The photometrical determination of magnesium, inorganic phosphor, copper, zinc and iron as well as the determination of enzyme activities was done by spectrophotometry. Flame photometry was used to determine concentrations of sodium, potassium and calcium. In the pretest, enzyme activities were significantly different on day 0 and 30 after freezing. Comparing day 1 with day 0, enzyme activities were only slightly reduced. We concluded from the pretest that freezing and thawing of seminal plasma samples in the main experiment has to be considered for interpretation of results; however, only a slight influence of this procedure on the results has to be expected. The following relevant results were found in the main experiment: • Alkaline Phosphatase, Aspartate-Amino-Transferase, Gamma-Glutamyl-Transferase and Lactate Dehydrogenase were highest in the second fraction of the ejaculate. • Acid Phosphatase and non-prostate specific Acid Phosphatase have similar activities in the second and third fraction. • Sodium concentrations were lowest in the second fraction. • Potassium, calcium and copper concentrations were similar in the second and third fraction. • Magnesium concentrations were highest in the third fraction. • Phosphate concentrations were highest in the second fraction. • Comparing normospermia and pathospermia, significant differences were found in the first fraction for total calcium concentrations (p = 0,036) with lower concentrations in case of pathospermia. • Comparing normospermia and pathospermia, significant differences were found for copper concentrations in the second (p = 0,001) and third fraction (p = 0,027) with higher concentrations in case of pathospermia. • Comparing normospermia and pathospermia, significant differences were found for activity of the Alkaline Phosphatase (p = 0,045) in the third fraction with lower activities in case of pathospermia. • Comparing normospermia and pathospermia, significant differences were found for total calcium concentrations (p = 0,002) with lower concentrations in case of pathospermia. The results of this study show different enzyme activities and element concentrations in the seminal plasma of the three fractions of the canine ejaculate. This indicates a different involvement of the sexual glands in the release of the examined parameters. Future studies are necessary to determine if there is a breed or age specificity in the composition of seminal plasma. Besides, the present results document significant differences for concentrations of copper, potassium, calcium and the activity of the Alkaline Phosphatase. We conclude that deviations of the biochemical composition of the seminal plasma may be related to dysfunction or diseases of the sexual glands and therefore could be related to sub- or infertility