Einfluss des Calcium-aktivierten Kaliumkanals auf die Lysophosphatidylcholin induzierte Monozytenadhäsion an humanen Endothelzellen

Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob die Lysophosphatidylcholin (LPC) induzierte Aktivierung des BKCa an der Monozytenadhäsion von U937-Zellen an humanen Nabelschnur Endothelzellen (HUVEC) beteiligt ist. Dabei wurde der Einfluss des BKCa auf das Membranpotential mit dem Fluoreszenzfarbstoff DiBAC gemessen. Die calcium- und radikalabhängige Adhäsion wurde mit Hilfe des 3[H]-Thymidin-Adhäsions-Assays untersucht. Die calcium- und radikalabhängige Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen. LPC induzierte eine konzentrationsabhängige Hyperpolarisation von HUVEC mit einem Maximum bei 20 myM. Weitere Konzentrationserhöhungen zeigten hierbei keinen steigernden Effekt. Deshalb wurden alle weiteren Versuche mit einer Konzentration von 20 myM durchgeführt. Der hoch spezifische BKCa-Inhibitor Iberiotoxin (IBX) konnte die Hyperpolarisation verhindern (IBX, 100 nM). Dies deutet darauf hin, dass dieser Ionenkanal für die Hyperpolarisation der Zellmembran verantwortlich ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Adhäsion von unstimulierten U937-Zellen durch Stimulation der HUVEC mit LPC verstärkt werden konnte. Dieser Effekt war zeitlich abhängig und nach t=4 Stunden gegenüber der Kontrolle signifikant. Die Stimulation von U937-Zellen führte nicht zu einer Steigerung der Adhäsion an unstimulierten HUVEC. Dies deutet darauf hin, dass die Adhäsion hauptsächlich von endothelialer Seite auszugehen scheint. Die LPC induzierte Adhäsion konnte signifikant verringert werden, wenn die HUVEC mit IBX, beziehungsweise dem NADPH-Oxidase-Inhibitor Diphenyleneiodonium (DPI, 5 myM) koinkubiert wurden. Ebenfalls verringerte die Hemmung der intrazellulären Calciumkonzentration durch den Calciumkanalblocker 2-amino-ethoxy-diphenyl-borate (2-APB, 100 myM) sowie den Calciumchelator BAPTA (10 myM) die LPC induzierte Adhäsion signifikant. In den FACS-Versuchen konnte LPC die Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM signifikant steigern. Durch Zugabe von IBX, DPI und BAPTA wurde die Expression von ICAM und VCAM ebenfalls signifikant verringert. Zusammenfassend kann man sagen, dass die zeitabhängige Adhäsion sowie die Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM und VCAM von der intrazellulären Calcium- und Radikalkonzentration abhängig sind und diese vom BKCa reguliert werden.Aim of this study was to investigate whether LPC-induced activation of BKCa is also involved in monocyte adhesion of U937-cells to human umbilical cord endothelial cells (HUVEC). Therefore the influence of BKCa to membrane potential was measured with DiBAC-fluorencence-dye. The calcium and ROS-dependent adhesion was examined by using the 3[H]-thymidine-adhesion-assay. The calcium and ROSdependent expression of adhesion molecules ICAM and VCAM was analysed with flow-cytometry. LPC induced a hyperpolarization of HUVEC in a dose-dependent manner with the maximum of 20 myM. Higher doses of LPC did not further enhance hyperpolarization. For this reason all following experiments were performed using a concentration of 20 myM. The highly specific BKCa-inhibitor Iberiotoxin (IBX) prevented hyperpolarisation (IBX, 100 nM). This indicates that this ion channel is responsible for the hyperpolarization of the cellmembrane. Adhesion of untreated U937 cells to HUVEC was increased after stimulation of HUVEC with LPC. This effect was time-dependent with a maximum observed after t=4 hours. On the other hand, stimulation of U937 cells with LPC did not cause enhancement of adhesion to unstimulated HUVEC. This indicates that the process of adhesion is mainly caused by endothelial cells. LPC-induced adhesion was significantly reduced when HUVEC were co-incubated with IBX, NADPH-oxidase inhibitor diphenyleneiodonium (DPI, 5 myM) or by addition of calcium channel-blocker 2-amino-ethoxy-diphenyl-borate (2-APB, 100 myM) or the calcium-chelator BAPTA (10 myM) to reduce intracellular calcium concentration. In FACS analyses LPC enhanced the expression of adhesion molecules ICAM and VCAM. In Addition to LPC IBX, DPI and BAPTA significantly decreased ICAM and VCAM expression. In conclusion the experiments demonstrate that time-dependent adhesion as well as the expression of adhesion molecules ICAM and VCAM depends on intracellular concentration of calcium and reactive oxygen species which are regulated by BKCa