Chemopreventive and sensitizing effects of phytochemicals in a cell culture model of colorectal cancer

Sulforaphan (SFN), ein natürlich vorkommendes Isothiocyanat, das vorwiegend in Kreuzblütlern zu finden ist, gilt aufgrund seiner potenten antikanzerogenen Wirkung als effektive, chemopräventiv wirkende Substanz. In früheren Studien konnte über eine Modulation des Polyaminstoffwechsels, insbesondere über eine Hemmung der biosynthetischen Ornithin Deacarboxylase (ODC), eine Hemmung des Zellwachstums in kolorektalen Karzinomzellen beobachtet werden. Ein Ziel unserer Arbeit war es daher, eine mögliche Sulforaphan- vermittelte Regulation der ODC sowie die Rolle des Transforming growth factor-beta (TGF-beta) in der SFN-induzierten Zellproliferationshemmung in Kolonkarzinomzellen näher zu charakterisieren. In der Behandlung solider Tumore limitieren sowohl die Ausbildung von Resistenzen als auch die Toxizität der chemotherapeutischen Substanzen den Erfolg der Therapie. Ein kombinierter Einsatz sekundärer Pflanzenstoffe mit konventionellen Chemotherapeutika könnte durch synergistische Effekte auf verschiedene Signaltransduktionswege sowohl eine Steigerung der antikarzinogenen Wirkungen, sowie eine Verminderung von Chemoresistenzen bewirken. Resveratrol ist ein natürlich vorkommendes Polyphenol, das vorwiegend in Trauben, Erdnüssen und Rotwein zu finden ist. Neben kardioprotektiven und antiinflammatorischen Wirkungen werden Resveratrol auch verschiedene chemopräventive und chemotherapeutische Eigenschaften zugesprochen. Ein weiteres Ziel war es daher, mögliche synergistische Wirkungen von Sulforaphan und Resveratrol in Kombination mit Oxaliplatin in Kolonkarzinomzelllinien genauer zu charakterisieren. Sulforaphan [1-50myM] hemmte konzentrationsabhängig Zellwachstum und –proliferation in Caco-2-Zellen. Weiterhin führte die Inkubation mit SFN zu einer dosisabhängigen Verminderung von ODC-Protein und – Aktivität nach 24 h, was eng mit den antiproliferativen Wirkungen korreliert. Zudem verminderte SFN sowohl die Proteinlevel als auch die Transaktivierung des Transkriptionsfaktors c-myc, der durch Bindung an eine spezifische DNASequenz die ODC direkt reguliert. Eine Beteiligung des TGF-beta Signalweges konnte durch die Zugabe des TGF-beta Rezeptor Kinase Inhibitors SB431542, der die SFN vermittelten Wirkungen auf ODC und Zellwachstum weitestgehend aufgehoben hat, weiter bestätigt werden. Des Weiteren hemmten SFN und Res in Kombination mit Ox synergistisch das Zellwachstum in Caco-2 Zellen. Nach kombinierter Behandlung mit SFN/Ox oder Res/Ox konnten zudem ausgeprägte morphologische Veränderungen, u.a. reduzierte ATP-Level, Caspase-3-Aktivierung und DNA Fragmentierung, die typischerweise im Zusammenhang mit Apoptose auftreten, beobachtet werden. Weiterhin konnte neben einer apoptotischen auch eine gesteigerte nekrotische Zellpopulation nachgewiesen werden, die im Falle von Resveratrol mit einer signifikant reduzierten Ausschüttung des anti-inflammatorischen Interleukin-10 einhergeht aus humanen Makrophagen. Ergänzend zeigten weder Sulforaphan noch Resveratrol in Kombination mit Oxaliplatin zytotoxische Effekte in nichttransformiertem Zellen. Die vorliegenden Daten zeigen erstmals, dass SFN seine antikanzerogenen Effekte, zumindest teilweise, über die Hemmung der ODC vermittelt. Dabei scheint die TGF-beta-Signalkaskade eine regulatorische Schlüsselrolle einzunehmen. Weitere Daten lassen darauf schließen, dass SFN und Res in Kombination mit Oxaliplatin synergistisch das Zellwachstum von Kolonkarzinomzellen durch Apoptose-Induktion hemmen. Diese in vitro Daten weisen auf potente chemopräventive und –therapeutische Eigenschaften der sekundären Pflanzeninhaltsstoffe Sulforaphan und Resveratrol hin, wodurch diese vielversprechende Substanzen in der Entwicklung neuer Therapiekonzepte in der Behandlung des kolorektalen Karzinoms darstellen.Sulforaphane (SFN), a naturally occuring isothiocyante present in cruciferous vegetables, is an attractive target due to its wide range of biological and pharmacological properties. In addition to anti-inflammatory activities, potent chemopreventive effects of SFN in various carcinogenesis models are described whereas the underlying molecular mechanisms remain partially unknown. Previous studies could demonstrate that modulation of polyamine metabolism provides a chemopreventive strategy of different phytochemicals. Inhibition of the biosynthetic key enzyme ornithine decarboxylase (ODC) is associated with reduced cell growth in several human cancers. Thus, one aim of this work was to elucidate a possible regulation of ODC by sulforaphane and to further specify a possible role of the transforming growth factor-beta (TGF-beta)- signaling pathway. Chemotherapy plays an important role in the overall treatment of colorectal cancer but the effectiveness is often limited by tumor drug resistance and severe side effects. Thus, the use of natural agents in combination with traditional chemotherapeutic drugs is a promising strategy for enhancing the therapeutic outcome. Due to their anticarcinogenic properties and their low toxicity, multiple phytochemicals may serve as potent agents for enhancing the therapeutic effect of classical chemotherapeutics. Resveratrol (Res), a natural occurring polyphenol present in red wine, peanuts and grapes, has been reported to exhibit a wide range of biological and pharmacological properties. In addition to cardioprotective and anti-inflammatory effects, also chemopreventive as well as chemosensitizing activities of Res in various carcionogenesis models are described. Therefore, another aim of this work was to investigate whether the isiothiocyante sulforaphane and the polyphenol resveratrol may potentiate the antitumor activities of the common chemotherapeutic oxaliplatin (Ox) in a cell culture model of colorectal cancer. SFN [1-50mymol/L] inhibites cell growth of Caco-2 cells in a dose- and time-dependent manner, which closely correlates with a dose-dependent reduction of ODC protein expression and activity after 24 h of incubation. This effect seems to be due to reduced protein levels and transactivation activity of transcription factor c-myc, a direct regulator of ODC expression, as a consequence of SFN-induced TGF-beta/Smad signaling. The coherency of these results was further confirmed by using TGF-beta receptor kinase inhibitor SB431542, which largely abolished inhibitory effects of SFN on both, ODC enzyme activity and tumor cell growth. Moreover, SFN, Res and Ox alone inhibited cell growth of Caco-2-cells in a dose-dependent manner, an effect, which could be synergistically enhanced, when cells were incubated with the combination of SFN/Ox or Res/Ox. Co-treated cells further displayed distinctive morphological changes that occurred during the apoptotic process, such as cell surface exposure of phosphatidylserine, membrane blebbing as well as the occurence of cytoplasmic histone-associated DNA fragments. Further observations thereby pointed towards simultaneous activation of both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. With increasing concentrations and treatment duration, a shift from apoptotic to necrotic cell death could be observed. Furthermore, cytotoxic effects of Res and Ox led to an altered cytokine profile of co-cultured macrophages. In addition, combinatorial treatment did not affect normal cells as cytotoxicity was not detected in human foreskin fibroblasts and in human platelets. On the basis of these findings, diet-derived sulforaphane downregulated ODC expression and activity in colorectal cancer cells, whereby activation of the TGFbeta signaling pathway seemed to play a pivotal role. Since eleVI vated ODC enzyme activity is associated with enhanced tumor development, SFN thus may be a dietary phytochemical with potential to prevent carcinogenesis. Moreover, sulforaphane as well as resveratrol enhanced oxaliplatin-induced cell growth inhibition via induction of different modes of cell death without damaging non-transformed cells. In addition, resveratrol also showed the peculiarity to abrogate immunosuppressive properties of oxaliplatin-treated cells. Due to these results both phytochemicals show great chemopreventive and therapeutic potential in the treatment of colorectal cancer