Entwicklung und Prüfung eines Impfstoffes gegen die Ödemkrankheit der Schweine

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Toxoidimpfstoffe gegen die Ödemkrankheit der Schweine auf der Basis von rekombinantem Shigatoxin vom Typ 2e (rStx2e) zu entwickeln und ihre Wirksamkeit an Ferkeln zu prüfen. Die Stx2e-Gene stxA2e und stxB2e des E. coli-Stammes „412“ wurden in den Plasmidvektor pET-24b(+) inseriert und in kompetenten E. coli BLR(DE3)-Zellen kloniert. Die Identität aller rStx2e-Transformanten bzw. die ordnungsgemäße Klonierung und Expression der Stx2e- Gene wurde mit Hilfe von PCR, Sequenzierung, Tricine-SDS-PAGE, Immunoblot und Verozell- Zytotoxizitätstest überprüft. Für die Wirksamkeitsprüfung von Impfstoffen wurde ein standardisiertes und kontrolliertes Ödemkrankheitsmodell etabliert, bei dem rStx2e intravenös an sechs Wochen alte Ferkel verabreicht wurde. In Abhängigkeit von der Dosis traten nach wenigen Stunden typische Symptome der Ödemkrankheit auf (Unterhautschwellungen an Augenlidern und Nasenrücken, Ataxien, Krämpfe, Festliegen, Ruderbewegungen, Todesfälle). In Anlehnung an die Europäische Pharmakopöe wurde die Belastungsdosis auf 750.000 CD50 pro Ferkel eingestellt (mind. 40 % Mortalität und 85 % Morbidität). Zur Verwendung als Impfantigen wurde rStx2e chemisch inaktiviert, indem es mit Glutaroder Formaldehyd behandelt wurde (rStx2eGA und rStx2eFA). In einem alternativen Ansatz wurden auf gentechnischem Wege rStx2e-Varianten erzeugt, in denen eine, zwei oder drei bestimmte Aminosäuren in der A-Untereinheit des Toxins (E167Q, R170L, A216D) substituiert worden waren. Die Aldehydbehandlungen reduzierten die toxische Aktivität des rStx2e gegenüber Verozellen um den Faktor 1.000 - 2.000, verminderten aber auch die Erkennung des Antigens durch Antikörper im ELISA. Die gentechnisch hergestellte Variante rStx2eE167QR170L war um den Faktor 132.278 weniger toxisch als unverändertes rStx2e. Die genetisch veränderten rStx2e-Varianten wurden von den entsprechenden E. coli BLR(DE3)- Stämmen stärker exprimiert als unverändertes Stx2e. Zur Überprüfung ihrer Immunogenität wurden die rStx2e-Impfantigene mit verschiedenen Adjuvantien (Aluminiumhydroxid, Montanide) vermischt und an den Lebenstagen 9 und 28 intramuskulär an Saugferkel verimpft. Placebo-geimpfte und nicht geimpfte Ferkel dienten als Kontrollen. Einige Tage nach dem Absetzen (Lebenstag 37 oder 38) wurden alle Ferkel intravenös mit rStx2e belastet. Vor und nach der Impfung sowie nach der Belastung wurden Serumproben genommen und auf E. coli-spezifische Antikörper (ELISArStx2e) sowie rStx2eneutralisierende Antikörper (Stx2e-Neutralisationstest) untersucht. Alle getesteten Toxoidimpfstoffe wirkten protektiv, was sich an der im Vergleich zur Kontrollgruppe geringeren Mortalität in den Impfgruppen äußerte. Von dem mit rStx2eGA-Antigen geimpften Ferkeln (Antigendosis ≥ 750.000 CD50-Äquivalente) überlebten 98 % die rStx2e- Belastung. Bei Impfung mit 150.000 CD50-Äquivalenten überlebten noch 83,4 %, bei 15.000 CD50-Äquivalenten nur 28,6 %. Mit einer Dosis von 1.500 CD50-Äquivalenten war kein Ferkel zu schützen. Von den Ferkeln, die mit Toxoidimpfstoffen auf Basis von rStx2eE167QR170L geimpft worden waren, überlebten 82 % die rStx2e-Belastung, wobei die Mortalitäten in den einzelnen Gruppen je nach eingesetztem Adjuvans deutlich differierten. So überlebten bei Verwendung der Montanide IMS1313 und IMS251C alle Ferkel, dagegen bei Aluminiumhydroxid nur 60 % der Ferkel. Nach der ersten Immunisierung waren Stx2e-neutralisierende Antikörper nur bei drei (rStx2eGA) der insgesamt 160 mit rStx2eGA- bzw. rStx2eE167QR170L-Toxoidvakzinen geimpften Ferkel (1,9 %) nachweisbar, nach der zweiten Immunisierung dagegen bei 80 % der Ferkel. Bei 92 % der geimpften Ferkel, welche die rStx2e-Belastung überlebten, waren vor der Belastung Stx2e-neutralisierende Antikörper vorhanden gewesen. Alle Ferkel mit einem Titer von >= 10 StdNT % überlebten die rStx2e-Belastung. Die höchsten Titer an Stx2e-neutralisierenden Antikörpern wurden mit dem rStx2eGA-Impfstoff in einer Antigendosis von 1,5 oder 0,75 Mio CD50-Äquivalenten sowie dem rStx2eE167QR170L-Impfstoff in Kombination mit IMS1313 und IMS251C als Adjuvans erzielt. Bei den Kontrollferkeln waren Stx2eneutralisierende Antikörper vor der rStx2e-Belastung in keinem einzigen Fall nachweisbar. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass sowohl die chemisch als auch die gentechnisch inaktivierten rStx2e-Impfantigene im Ferkel eine sehr gute immunogene und protektive Wirkung haben und sich daher zur Herstellung von Toxoidvakzinen gegen die Ödemkrankheit eignen. Um eine hohe Schutzwirkung zu erzielen, ist eine zweimalige Immunisierung mit einer minimalen Impfantigendosis von jeweils 750.000 CD50-Äquivalenten (rStx2eGA-Antigen) bzw. 15.750 OD50 (rStx2eE167QR170L-Antigen) erforderlich. Das Ödemkrankheitsmodell ist zur Wirksamkeitsprüfung von Stx2e-Toxoidimpfstoffen sehr gut geeignet, es ist aber auch aufwändig und mit Leiden für die Tiere verbunden. Die Quantifizierung von Stx2e-neutralisierenden Antikörpern kann entsprechende Versuche zumindest in einigen Fällen ersetzen.The objective of the present study was the development and evaluation of toxoid vaccines based on recombinant Shigatoxin 2e (rStx2e) in order to immunize piglets against edema disease. The Stx2e genes stxA2e and stxB2e of E. coli strain “412” were transferred into the plasmid pET-24b(+) by recombinant DNA technologies and cloned into competent cells of E. coli strain BLR(DE3). The identity of all rStx2e transformants and the correct cloning and expression of the Stx2e genes were confirmed by PCR, DNA sequencing, Tricine-SDSPAGE, immunoblot analysis and a vero cell cytotoxicity assay. In order to test Stx2e-toxoid vaccines for their efficacy a standardized and controlled edema disease model was established where rStx2e was administered intravenously to piglets at six weeks of age. Dependent on the amount of rStx2e administered typical signs of edema disease occurred within a few hours (subcutaneous swelling of eyelids and nosebridges, staggering gaits, paddling, spasms and ataxia). According to the European Pharmacopoeia the rStx2e challenge dose to be used in immunization trials was defined as 750.000 CD50 per piglet (minimum mortality and morbidity in the control group: 40 % and 85 %, respectively). Prior to its use as an antigen in vaccines, rStx2e was chemically inactivated by treatment with glutaraldehyde or formaldehyde (rStx2eGA und rStx2eFA). In an alternative approach genetic engineering was used to generate variants of rStx2e which carried one, two or three amino acid substitutions at defined residues in the A-subunit of Stx2e (E167Q, R170L, A216D). Treatment with glutaraldehyde or formaldehyde reduced the cytotoxicity of rStx2e towards Vero cells by a factor of 1000 to 2000. However, this treatment also impaired the detectability of rStx2e by antibodies in an ELISA. The variant rStx2eE167QR170L was 132.278 times less toxic than non-modified rStx2e. In addition, both modified rStx2e variants were produced at higher rates than non-modified rStx2e by their respective E. coli strains. In order to prove their immunogenicity rStx2e antigens were mixed with various adjuvants (aluminium hydroxide, montanides) and administered intramuscularly to suckling piglets at days 9 and 28 of life. Non-vaccinated piglets and piglets vaccinated with a placebo served as controls. A few days after weaning (day 37 or 38) each piglet was challenged intravenously with rStx2e. Prior to and after vaccination as well as after the challenge blood samples were collected and tested for E. coli specific (ELISArStx2e) and Stx2e-neutralizing antibodies (Stx2e-neutralization assay). All tested rStx2e-toxoid vaccines proved protective which manifested itself as a reduced mortality in groups of vaccinated piglets compared to the controls. Piglets survived the rStx2e challenge at 98 %, if they had been vaccinated with rStx2eGA (antigen dose ≥ 750.000 CD50 equivalents). Vaccination with doses of 150.000 and 15.000 CD50 equivalents resulted in considerable less survivors (83.4 % and 28.6 %, respectively). No protection was achieved by immunization with a dose of 1.500 CD50 equivalents. Among all piglets vaccinated with rStx2eE167QR170L 82 % were able to survive the rStx2e challenge. However, the mortalities in the groups varied considerably depending on the type of adjuvant employed. In cases where montanides IMS1313 and IMS251C were used all piglets survived, while only 60 % of the piglets survived when vaccines had been supplemented with aluminium hydroxyde. Stx2e neutralizing antibodies were detected only in three (rStx2eGA) of 160 piglets (1.9 %) after the first shot of the rStx2eGA- or rStx2eE167QR170L-toxoid vaccines, respectively. However, 80 % proved positive after the second shot. In 92 % of the immunized piglets which survived the rStx2e challenge Stx2e-neutralizing antibodies had been present prior to the challenge. All piglets with a titer of ≥ 10 StdNT % survived the challenge. Administration of the rStx2eGAvaccine (antigen doses of 1.5 or 0.75 Mio CD50 equivalents) or the rStx2eE167QR170L-vaccine supplemented with IMS1313 or IMS251C yielded the highest titres of Stx2e-neutralizing antibodies. None of the control piglets showed Stx2e neutralizing antibodies prior to the exposure to rStx2e. Results suggest that both chemically as well as genetically inactivated rStx2e represent very valuable immunogenic and protective antigens for the production of toxoid vaccines against edema disease. In order to achieve highest degrees of protection it appears essential to vaccinate piglets twice with a minimal dose of 750.000 CD50 equivalents (antigen rStx2eGA) or 15.750 OD50 (antigen rStx2eE167QR170L), respectively, at each time point. The edema disease model is a valuable tool to assess the efficacy of Stx2e-toxoid vaccines. However, this model is laborious and may raise objections due to ethical aspects. At least in some cases it can be replaced by the assessment of Stx2e-neutralizing antibodies in blood samples