Pigmentsynthese bei Exophiala dermatitidis : Einfluss auf Phagozytose und Oxidative Burst

Indolderivate wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. Mayser 1998 erstmals bei der Hefe Malassezia furfur beschrieben, bei der sie vermutlich in einem klinischen Zusammenhang mit der Hautkrankheit Pityriasis versicolor stehen. Im Jahr 2006 konnten Nies et al. solche Indolderivate erstmals bei Exophiala dermatitidis nachweisen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Untersuchung der Pigmentspektren verschiedener Stämme von Exophiala dermatitidis und ihre Überprüfung auf eine mögliche Rolle in der Pathogenese von Exophiala-dermatitidis-Infektionen. Hierfür wurden der Wildtyp und seine Mutanten Mel-1, Mel-3 und Mel-4 zur Pigmentsynthese auf 1b-Minimalagar angezüchtet. Nach vierwöchiger Wachstumsphase wurde das dabei entstandene Pigment als Rohextrakt gewonnen, durch chromatographische Methoden vorgereinigt, sowie einzelne farbige Bestandteile weiter aufgereinigt. Die Stukturaufklärung isolierter Reinsubstanzen erfolgte an der TU München. Grundlage zur Untersuchung des Oxidative Burst stellte der von Schnitzler et al. (1999) etablierte Vollblutansatz mit Dihydrorhodamine 123 als Indikator für die Sauerstoffradikalsynthese von neutrophilen Granulozyten dar. Die anschließende Messung erfolgte am Durchflußzytometer. Im Rahmen der Untersuchung der Pigmentspektren konnte beim Wildtyp von Exophiala dermatitidis erstmals die Synthese von Pityriacitrin, Pityriarubin C, Exophialin und Desoxyexophialin nachgewiesen werden. Für die Mutante Mel-1 konnte erstmals das bislang nur durch vergleichende DC nachgewiesene Pityriacitrin in der HPLC, sowie durch Analyse der TU München bestätigt werden. Desweiteren konnte Exophialin aus zwei violetten Banden mit einem Rf-Wert von 0,38 und 0,56 isoliert werden. Unter den Syntheseprodukten der Mutante Mel-3 wurde erstmals Exophialin, Pityriarubin C und Pityriacitrin nachgewiesen. Beim Vergleich des Wildtyps von Exophiala dermatitidis mit seiner Melaninmangel-Mutante Mel-3 hinsichtlich ihrer Auswirkung auf den Oxidative Burst in Vollblutproben konnte eine deutliche Hemmung des Oxidative Burst durch den Wildtyp gegenüber Mel-3 aufgezeigt werden. Dies läßt den Rückschluß auf eine deutliche Schutzwirkung des vom Wildtyp synthetisierten Melanins vor der ROS-Synthese zu. Auch die untersuchten Pigment-Rohextrakte von Wildtyp, Mel-1, Mel-3 und Mel-4 hatten alle eine hemmende Wirkung auf die ROS-Synthese, wobei der Rohextrakt von Mel-3 den stärksten Einfluß hatte. Bei den Sephadex-Fraktionen der Mutante Mel-3 ergaben unterschiedliche Einflüsse auf die ROS-Synthese. Die Fraktionen zwei und sechs zeigten in allen Zeitstufen zwischen 0 und 60 Minuten die stärkste Unterdrückung, wohingegen bei den Fraktionen drei und acht zu keinem Zeitpunkt Auswirkungen auf die ROS-Synthese beobachtet wurden. Nach weiterer Unterteilung der hemmenden Fraktion sechs der Mutante Mel-3 mittels präparativer Dünnschichtchromatographie in acht Banden konnte eine deutliche Hemmung des Oxidative Burst durch die Banden 5-8 verzeichnet werden. In diesem Bereich kam neben zahlreichen Fluorochromen und Pityriarubin C eine prominente Bande von grauer Farbe vor. Diese Substanz hemmte die ROS-Synthese deutlich, wohingegen Pityriarubin C keinen Einfluß darauf hatte. Auch die acht Banden der Fraktion zwei der Mutante Mel-3 unterschieden sich in ihrer Auswirkung auf den Oxidative Burst. Hier wirkten sich nur die Fraktionen 1,4,5 hemmend auf die ROS-Synthese aus. Die weiterhin untersuchten Reinsubstanzen Exophialin und Malassezin hatten selbst in hohen Konzentrationen keinen signifikanten Einfluß auf die ROS-Synthese. Insgesamt konnte gezeigt werden, daß Exophiala dermatitidis Wildtyp und seine Mutanten unter den eingesetzten Anzuchtbedingungen ein sehr unterschiedliches Spektrum an pigmentierten Indolderivaten bilden, das sich stets reproduzieren ließ. Es wurde eine Hemmung der ROS-Synthese durch diese Pigmente in Form von Rohextrakten einzelner Stämme, in Form weiter aufgereinigten Säulenchromatographie-Fraktionen, sowie in Form von Einzelbanden beobachtet. Die läßt Rückschlüsse auf deren wichtige Rolle in der Pathogenese von Exophiala dermatitidis-Infektionen bei Mensch und Tier zu. Die aus diesen Resultaten hervorgehenden neuen Fragestellungen sind weiteren Untersuchungen vorbehalten.In 1998, the working group of Prof. Mayser first described some particular indole derivatives in the yeast Malassezia furfur, which might be clinically related to the skin disease pityriasis versicolor. In 2006, Nies et al. were the first ones able to show the production of these indole derivatives in Exophiala dermatitidis. The aim of this study was to compare the pigment spectrum of different species of Exophiala dermatitidis and to clarify whether they are part of the pathogenese of infections with Exophiala dermatitidis. The wildtype and its mutants Mel-1, Mel-3 and Mel-4 were cultivated on minimal agar as a base for pigment production. The pigment was extracted after a period of growth of 4 weeks and chromatographically purified to obtain pure substances. Structural analyses of the isolated substances were performed at Munich Technological University. Following the studies of Schnitzler et al. (1999), unlabeled yeast cells were incubated in heparinized whole blood and dihydrorhodamine 123 was added as an indicator for the ROS-synthesis in the granulocytes. Flow cytometric analysis was performed in a FACScan flow cytometer. By investigating the pigment spectrum of Exophiala dermatitidis, the synthesis of Pityriacitrin, Pityriarubin C, Exophialin and Desoxyexophialin in the wildtype could be shown. In former studies, the pigments of the mutant Mel-1 were already investigated by comparative DC and the indole pyruvate Pityriacitrin was found to be produced by this yeast. In the present study, this achievement could be approved by HPLC and the analysis of Munich Technological University. Exophialin, an almost ankwown indole derivate which was isolated from Mel-3 for the first time by Nies et al. (2006) was found in two violet DC-bands of Mel-1 (Rf=0,38; Rf=0,56). The indole derivates Exophialin, Pityriarubin C and Pityriacitrin were detected in the mutant Mel-3 in this present study. The degree of the oxidative burst evoked by Exophiala dermatitidis wildtype was found to be lower when it was compared with its mutant Mel-3. The wildtype is probably protected from the oxidative burst by its synthesised Melanin. When the raw extracts of the wildtype, Mel-1, Mel-3 and Mel-4 were added in the experimental series of oxidative burst, evoked oxidative burst levels were also found to be lower compared with the contol without any indole derivates. The raw extract of Mel-3 inhibited the oxidative burst most. The sephadex-fractions of the mutant Mel-3 had different influences on the synthesis of ROS. Fractions two and six suppressed the oxidative burst in all time levels between 0 and 60 minutes strongly, while fractions three and eight had no influence on the synthesis of ROS at any time. Fraction six was subdivided by preparative thin layer chromatography into eight bands and the bands 5-8 were able to inhibit evoked oxidative burst levels. Beside the already known Pityriarubin C and other fluorochromes these three bands 5-8 include an unknown greycoloured pigment. This grey pigment was able to inhibit the synthesis of ROS strongly, while Pityriarubin C had no influence on the evoked oxidative burst. The eight bands of fraction two of the mutant Mel-3 differed in the way tey influenzed the oxidative burst. Only fractions 1,4,5 led to a decreased oxidative burst level. Although added in high concentrations, the pure substances Exophialin and Malassezin did not have any influence on the synthesis of ROS. I summary can be said that the wildtype of Exophiala dermatitidis an its mutants are able to produce a very bright and different spectrum of pigmented indole derivates when cultivated on minimal agar. This pigment spectrum is reproducable at any time. An inhibition of the ROS synthesis was shown by these indole derivates when they were added as raw extracts, fractions of thin layer chromatographie and as single bunches. The indole derivates seem to play an important role in the pathogenesis of infections in human beings and animals caused by Exophiala dermatitidis