Beitrag von Rho sowie G12/13, Gq/11 und Gi Proteinen zur Signaltransduktion über Proteinase aktivierbare Rezeptoren nach Stimulation mit den Serinproteinasen aktiviertes Protein C, Thrombin und Faktor Xa

Die Serinproteinasen a) aktiviertes Protein C (APC), b) Thrombin und c) Faktor Xa kommen ubiquitär in Prokaryonten und Eukaryonten vor und wirken mit bei der Homöostase, der Fibrinolyse, der Blutgerinnung und beim Proteinverdau. Desweiteren spielen sie eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der G-Protein gekoppelten Proteinase aktivierbaren Rezeptoren. Nach den positiven Ergebnissen aus der PROWESS Studie (Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis), die zeigten, dass APC die Mortalität bei schwerer Sepsis reduzierte, wurden dem APC neben den antigoagulativen auch antiinflammatorische Wirkungen zugeschrieben. Diese direkten antiinflammatorischen Wirkungen des APC wurden bisher jedoch nur in vitro nachgewiesen. Neuere Studien zweifeln diese protektiven Wirkungen an. Demgegenüber wirken Thrombin, als Schlüsselenzym der Gerinnungskaskade, und Faktor Xa, ebenfalls ein wichtiger Bestandteil der Blutgerinnung, proinflammatorisch und prokoagulativ. Dabei ist bisher nicht bekannt, wie APC antiinflammatorische Effekte über den Proteinase aktivierbaren Rezeptor 1 (PAR1) steuert, während Thrombin bzw. Faktor Xa über denselben Rezeptor proinflammatorische Wirkungen hervorrufen. Über eine Beteiligung des Proteinase aktivierbaren Rezeptors 2 (PAR 2) bzw. des Sphingosin-1-Phosphat Rezeptors (S1P1) an diesen „protektiven versus destruktiven“ Effekten ist bisher ebenfalls wenig bekannt. Die weitere Erforschung und Aufklärung dieser molekularen Wirkungsmechanismen ist von großer Bedeutung für das pathophysiologische Verständnis des Sepsisgeschehens und damit einhergehend für die Therapie der Sepsis. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten nach Etablierung des SRE abhängigen Luciferase Assays die bisher bekannten molekularen Mechanismen der APC-, Thrombin- bzw. Faktor Xa- Wirkungen in HEKTsA201-Zellen nachgestellt bzw. neue Mechanismen und mögliche Unterschiede in der molekularen Wirkungsweise aufgedeckt werden. Das Hauptaugenmerk war dabei auf die heterotrimeren G-Proteine Ga 12/13, Ga q/11 und Ga i sowie auf die Rho GTPase Rho bzw. die Rho abhängige Kinase ROCK gerichtet. In unseren Versuchen konnten wir in mit den Proteinase aktivierbaren Rezeptoren 1 und 2 transfizierten HEKTsA201-Zellen dosis- und zeitabhängige Steigerungen der Luciferase Aktivitäten durch die Serinproteinasen rhAPC, Thrombin und Faktor Xa sowie durch die PAR aktivierenden Peptide TFLLRNPNDK-NH2 und SLIGKV-OH feststellen. Die Kostimulationen von rhAPC mit Thrombin bzw. Faktor Xa im Luciferase Assay an HEKTsA201-Zellen ergaben im Gegensatz zur bisher in der Literatur vertretenen Meinung der protektiven APC Wirkung dosisabhängige und zeitunabhängige „additive Effekte“ der Agonisten. Bezüglich des Rezeptor signalings konnten im Rahmen dieser Arbeit im Luciferase-Assay an HEKTsA201-Zellen keine Unterschiede von APC gegenüber Thrombin bzw. Faktor Xa aufgedeckt werden. Die verschiedenen Experimente zur Hemmung der jeweiligen heterotrimeren G-Proteine bzw. Rho/ROCK ergaben, dass die Serinproteinasen rhAPC, Thrombin und Faktor Xa über Ga 12/13, Ga q/11 und Rho/ROCK wirken, nicht jedoch über Ga i. Weitere in vitro bzw. in vivo Untersuchungen bezüglich einer „protektiven APC Wirkung“ müssen klären, ob die hier vorgeschlagenen Mechanismen in vivo bedeutsam sind.The serine proteinases a) APC, b) Thrombin and c) Faktor Xa can be found ubiquitous in prokaryotes and eukaryotes and exert distinct functions in homeostasis, fibrinolysis, blood coagulation and protein digest. Furthermore APC, Thrombin and Faktor Xa play an important role by activating G-Protein coupled Proteinase Activated Receptors. After it has been shown within the PROWESS-Study (Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis) that APC decreases the mortality of severe sepsis, APC was characterized as not only anti-coagulant but as also anti-inflammatory. However, direct anti-inflammatory properties of APC were only shown in vitro. Recent studies challenge these anti-inflammatory effects of APC. In contrast to these protective properties of APC the properties of both Thrombin and Factor Xa as important key enzymes in the blood coagulation cascade are pro-inflammatory and pro-coagulant. It is not known how APC exerts anti-inflammatory effects through the Proteinase Activated Receptor 1, while Thrombin and Factor Xa exert pro-inflammatory properties through the same receptor. Furthermore the significance of Proteinase Activated Receptor 2 as well as Sphingosin-1-Phosphate Receptor in this "protective versus destructive" process is also not known. Further investigation and enlightenment of these molecular functions are very important to understand the pathophysiological pathways in sepsis and sepsis treatment. After the establishment of a SRE constrained Luciferase Assay the focus of this study was to identify molecular mechanisms of APC, Thrombin and Factor Xa on HEKTsA201 cells and to show possible differences in the signaling pathways. The main focus was dedicated to the heterotrimeric G proteins Ga12/13, Ga q/11 and Ga i as well as to Rho GTPase Rho and the Rho associated Kinase ROCK. In the present experiments it was shown that Proteinase Activated Receptors 1 and 2 transfected HEKTsA201 cells increase Luciferase activity time- and dose-dependently by stimulation with the serine proteinases rhAPC, Thrombin, Factor Xa and the PAR-activating peptides TFLLRNPNDK-NH2 and SLIGKV-OH. This is in contradiction to the opinion represented in the literature about APC acting as an only protective agent. We could show dose-dependent, but time-independent additive effects of these agonists. With respect to the receptor signaling no functional differences between the respective serine proteinases were found. In several heterorimeric G protein and Rho/ROCK restrain tests it was shown that the serine proteinases rhAPC, Thrombin and Factor Xa promote signaling through Ga12/13, Ga q/11 und Rho/ROCK, while Ga i signaling was not involved. Further in vitro and in vivo research concerning the protective properties of APC are needed to clarify the in vivo relevance of these proposed pathways