Pulmonal consequences of intrauterine growth restriction : construction of a murine animal model

Die intrauterine Wachstumsrestriktion (IUGR) wird als ein im Vergleich zur Referenzpopulation inadäquates pränatales Wachstum verstanden. Frühgeborene mit IUGR weisen eine stark erhöhte neonatale Morbidität und Mortalität auf. Diese werden wesentlich durch akute und chronische respiratorische Erkrankungen, wie dem respiratory distress syndrome (RDS) und der Bronchopulmonalen Dysplasie (BPD), bestimmt. Die erhöhte pulmonale Morbidität intrauterin Wachstumsretardierter wird auf eine gestörte intrauterine Lungenentwicklung zurückgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein Tiermodell zur experimentellen Induktion einer IUGR für die frühgeborene Maus zu etablieren. Die IUGR wurde durch maternale Hypoxie während des letzten Drittels der Gestation induziert. An Embryonaltag 17,5 erfolgte die Entbindung der Feten durch C-Sectio. Es konnten folgende Feststellungen getroffen werden: Die Feten aus der Gruppe mit maternaler Hypoxie wiesen in allen betrachteten auxologischen Merkmalen eine signifikante IUGR gegenüber den Feten der Kontrollgruppe auf. Da es zu einer Umverteilung des fetalen Wachstums zu Gunsten des Kopfes kam, ist die IUGR im vorliegenden Modell als asymmetrisch zu klassifizieren. Aufgrund der Bedeutung einer beeinträchtigten intrauterinen Lungenentwicklung für die postnatale pulmonale Morbidität wurden die Lungen der wachstumsretardierten Feten und Kontrolltiere auf Ebene der histologischen pulmonalen Differenzierung verglichen. Weiterhin wurde die pulmonale mRNA Expression essentieller Gene der Lungenentwicklung und –funktion untersucht. Es wurden folgende Gene ausgewählt: IGF-1, IGF1-R, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR-2, HIF-1alpha, HIF-2alpha, Surfactant assoziierten Proteine A-D (SP A-D), IL-6, IL-10, TNF-alpha Anhand einer vergleichenden histomorphometrischen Untersuchung der fetalen Lungen konnte kein signifikanter Unterschied der Lungendifferenzierung zwischen den IUGR und Kontrollfeten festgestellt werden. Die fetalen Lungen befanden sich zum Entnahmezeitpunkt im Übergang vom sakkulären zum kanalikulären Stadium der Lungenentwicklung, was dem Entwicklungsstand der humanen Lunge in der 24.-26. Schwangerschaftswoche entspricht. Die mRNA Expressionsanalysen erfolgten durch real-time PCR Assays (TaqMan®-Technologie, deltadeltaCt-Methode). Die vorliegende Studie konnte keine signifikanten Unterschiede betreffend der mRNA Expression von IGF-1 und seinem Hauptrezeptor IGF-1R im Lungengewebe der IUGR- und Kontrollgruppe nachweisen. Die mRNA Expression der HIF Untereinheiten HIF-2alpha zeigte eine signifikant niedrigere Expression in der Gruppe der IUGR Feten, wohingegen die HIF-1alpha mRNA Expression nicht signifikant beeinflusst wurde. Die geringere mRNA Expression des hypoxiesensitiven HIF-2alpha und die fehlende Beeinflussung der HIF-1alpha mRNA Expression lassen eine Hypoxie im pulmonalen Gewebe und somit auch eine systemische fetale Hypoxie unwahrscheinlich erscheinen. HIF-2alpha hat während der pränatalen Lungenentwicklung wesentlichen Einfluss auf die Induktion der VEGF Expression. In der vorliegenden Arbeit konnte eine niedrigere pulmonale Expression der VEGF mRNA in der Gruppe der IUGR Feten bei hoher Korrelation zur HIF-2alpha Expression nachgewiesen werden, während die mRNA der VEGF Rezeptoren (VEGFR-1, VEGFR-2) nicht unterschiedlich exprimiert wurde. Die geringere VEGF mRNA Expression in den Lungen der IUGR Feten kann Hinweis auf ein geringeres angiogenetisches Potential im pulmonalen Gewebe sein. Die mRNA Expression der SP A-C war in den Lungen der wachstumsretardierten Feten niedriger als in der Kontrollgruppe, wohingegen die mRNA Expression des SP D nicht beeinflusst wurde. Eine niedrige SP-B und SP-C mRNA Expression ist mit der Entstehung neonataler respiratorischer Störungen assoziiert. Daher ist die geringere pulmonale mRNA Expression dieser Faktoren in der Gruppe der IUGR Feten als prädispositionierender Faktor für respiratorische Erkrankungen zu werten. SP-A ist Teil der angeborenen pulmonalen Immunabwehr. Der niedrigeren SP-A mRNA Expression in der Gruppe der wachstumsretardierten Feten kann eine Rolle bei der beeinträchtigten lokalen Immunantwort intrauterin wachstumsretardierter Feten zukommen. Die fehlende Beeinflussung der mRNA Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 und TNF-alpha sowie eine erhöhte Expression des anti- inflammatorischen IL-10 in der Gruppe der Wachstumsretardierten macht eine intrauterine Inflammation im vorliegenden Modell unwahrscheinlich.The intrauterine growth restriction (IUGR) is defined as inadequate intrauterine growth compared with a reference population. Preterm infants with IUGR face an increased risk for neonatal morbidity and mortality which is mainly determined by the higher prevalence of acute and chronic respiratory disorders such as respiratory distress syndrome (RDS) and bronchopulmonary dysplasia (BPD). In general, the increased pulmonary morbidity of growth restricted infants seems to be associated with a perturbed intrauterine lung development. The aim of the present study was to establish an animal model for the experimental induction of IUGR in preterm mice. IUGR was induced by maternal hypoxia during the last third of gestation. Fetuses were delivered preterm at day 17.5 of gestation by caesarean section (term is 19-21 days). To evaluate the impact of maternal hypoxia on fetal growth variables of somatic growth were assessed. All variables of somatic growth were found to be significantly decreased in fetuses of the hypoxic group versus controls. Head growth of the hypoxic fetuses was less affected than body growth, thus the induced growth restriction was classified as asymmetric IUGR. The redistribution of fetal growth to the advantage of essential regions like the fetal head may indicate compensatory mechanisms due to an impaired intrauterine environment. With regard to intrauterine lung development and neonatal respiratory function we investigated lungs of IUGR and control fetuses using histomorphometric analysis of pulmonary tissue differentiation. In addition we investigated mRNA expression of genes revealed to be essential for lung maturation and differentiation: IGF-1, IGF1-R, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR-2, HIF-1alpha, HIF-2alpha, surfactant associated protein A-D (SP A-D), IL-6, IL-10, TNF-alpha Comparative histomorphometry revealed no significant differences in lung differentation in IUGR and control animals. Fetal lung maturation was assign to the terminal saccular to canalicular stage. Thus, the stage of lung development in the mouse model was similar to that in very preterm infants at 24 to 26 weeks of gestational age. Pulmonary mRNA expression was determined using the real-time PCR technique (TaqMan ®). Relative quantification was performed by using the ∆∆Ct method. Pulmonary mRNA expression of IGF-1 and IGF-1R in IUGR fetuses was similar to that of control animals. Messenger RNA expression of HIF-2alpha was found to be significantly lower in lung tissue of IUGR fetuses compared to controls whereas HIF-1alpha mRNA expression was not significantly altered. The lower mRNA expression of the hypoxia-sensitive transcription factor HIF-2alpha and the missing alteration of HIF-1alpha mRNA expression may be a sign of an irrelevant or absent pulmonary and consequently systemic fetal hypoxia. In the present study, IUGR fetuses showed a lower mRNA expression of VEGF whereas mRNA expression of the VEGF associated receptors (VEGFR-1, VEGFR-2) was not affected. The lower VEGF mRNA expression in the group of growth restricted mice may indicate a reduced angiogenetic potential in fetal lungs. Lower mRNA expressions of SP-A, -B and -C were also observed in the pulmonary tissue of growth restricted fetuses; however, SP-D mRNA expression was not affected. Surfactant associated proteins are known to play an essential role in mediation of biophysical surfactant activity. Reduced expressions of the hydrophobic proteins SP-B and -C are known to increase the risk for acute neonatal respiratory failure. Thus, the reduced mRNA expression of SP-B and -C in IUGR fetuses of the present study may have potential implications for postnatal pulmonary adaptation and the risk for the development of respiratory disorders in preterm neonates with IUGR. SP-A is described to be an important factor of the innate pulmonary host defence. The reduced mRNA expression of SP-A in lungs from IUGR fetuses may play a role in the impaired pulmonary immunity of growth restricted infants. Regarding the investigation of pro-inflammatory cytokines IL-6 und TNF-alpha in pulmonary tissue, no significant differences between IUGR fetuses and controls were found. Furthermore, mRNA expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10 was significantly higher in the group of fetuses with IUGR compared to control animals. These observations indicate that intrauterine inflammation does not seem to be involved in the established model of growth restriction