Charakterisierung der pyrogenen Eigenschaften des Fibroblasten-stimulierenden Lipopeptids-1 (FSL-1) beim Meerschweinchen

Mycoplasmen stellen eine große Gruppe prokariotischer Organismen dar, die sich von anderen Bakterien durch ihre geringe Größe und dem Fehlen einer Zellwand unterscheiden. Diacylierte Lipopeptide aus Mycoplasmen agieren als sogenannte „Pathogen- assoziierte Molekülstrukturen“ (PAMPs) und stimulieren das angeborene Immunsystem über das „Toll-like Receptor“ (TLRs)- 2/6 Heterodimer. Diese Aktivierung resultiert in einer Reihe von Symptomen einer APR, wie der Produktion proinflammatorischer Zytokine, Prostaglandine und NO, oder führt zu Fieber und „sickness behavior“. Im Mittelpunkt dieser Studie stand das Fibroblasten-stimulierende Lipopeptid-1 (FSL-1), das die N-terminale Sequenz eines 44 kDa schweren Lipoproteins aus Mycoplasma salivarium darstellt. Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, die pyrogenen Eigenschaften von FSL-1 anhand verschiedener Parameter in vivo zu charakterisieren. Intraarterielle (i.a.) und intraperitoneale (i.p.) Injektionen von FSL-1 führten bei Meerschweinchen zu einem dosisabhängigen Fieber, das von erhöhten zirkulierenden Spiegeln der proinflammatorischen Zytokine TNF und IL-6 begleitet war, wobei die i.p. Stimulationen im Vergleich zu den i.a. Injektionen effektiver waren. Mit Hilfe eines neutralisierenden löslichen TNF-Rezeptors (TNFbp) konnte gezeigt werden, dass TNF eine entscheidende Rolle bei dem durch FSL-1 induzierten Fieber spielt, da dieses durch die Behandlung mit TNFbp (i.a. und i.p.) fast vollständig unterdrückt werden konnte. TNF wurde hierbei vollständig neutralisiert, IL-6 in seiner Bildung deutlich abgeschwächt. Mittels eines unselektiven Zyklooxygenase (COX) Inhibitors (Diclofenac) und der Messung von zirkulierendem PGE2 konnte dann gezeigt werden, dass die Hemmung der Bildung von PGE2 ebenfalls bei beiden Applikationsformen einen entscheidenden Einfluss auf die Fieberentstehung durch FSL-1 hatte. Durch diese Maßnahme wurde das Fieber völlig unterdrückt, ohne dass die Bildung von TNF und IL-6 beeinträchtigt wurde. Die zirkulierenden Konzentrationen an PGE2 entsprachen bei Gabe von Diclofenac zusammen mit FSL-1 nur einem basalen Niveau, während es bei der Injektion von FSL-1 alleine zu einem deutlichen Anstieg kam. Um zu überprüfen, welche Gehirnregionen nach Gabe von FSL-1 aktiviert wurden, erfolgte mittels Immunhistochemie ein Nachweis von nukleären Signalen des Transkriptionsfaktors STAT3 im ZNS. STAT3 wird in diesem Zusammenhang als Indikator einer durch FSL-1 induzierten und durch IL-6 vermittelten Aktivierung von Gehirnzellen angesehen. Es konnten 120 Minuten nach Injektion von FSL-1 i.a. in Endothelzellen des gesamten Gehirns und in Strukturen mit teilweise offener Blut-Hirn Schranke (den CVOs: AP, OVLT, SFO) positive STAT3-Signale in Zellkernen nachgewiesen werden. In den CVOs traten nukleäre STAT3 Signale nicht nur in Endothelzellen sondern auch in Astrozyten auf. Schließlich wurde untersucht, ob wiederholte Konfrontation mit FSL-1 in kurzen Abständen zu Toleranzerscheinungen führte. Hierbei ergab sich, dass es durch wiederholte Applikationen von FSL-1 keine (i.a.) bzw. nur eine transiente (i.p.) Toleranzentwicklung hinsichtlich des Fiebers kam. Jedoch die Bildung der Zytokine TNF und IL-6 wurde bei wiederholter Stimulation mit FSL-1 mehr oder weniger stark abgeschwächt. Eine Kreuztoleranz zwischen FSL-1 und LPS unterblieb bei den intraarteriellen Applikationen, während sie sich bei den intraperitonealen Stimulationen manifestierte. Dies betraf sowohl die Reaktivität gegenüber FSL-1 nach wiederholter Vorbehandlung mit LPS als auch die Antwort auf LPS-Gabe nach wiederholter Vorstimulation mit FSL-1. Im Rahmen der Toleranzversuche wurden auch die anorektischen Eigenschaften von FSL-1 betrachtet. Während es bei LPS-Injektionen erwartungsgemäß zu einer Anorexie kam, die mit jeder weiteren Injektion schwächer wurde, waren die Ergebnisse bei wiederholten Injektionen von FSL-1 heterogener. So wird auch durch FSL-1 ein anorektischer Effekt vermittelt, der jedoch bei wiederholter Injektion dieses exogenen Pyrogens zumindest teilweise wieder aufgehoben wurde. Durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde die Pyrogenizität von FSL-1, einem mycoplasmaler Lipopeptid, eindeutig nachgewiesen, die zugrunde liegenden Mechanismen wurden weitgehend aufgeklärt. Es zeigte sich, dass FSL-1 aus M. salivarium zum Teil über ähnliche Mechanismen Fieber induziert wie das „klassische“ exogene Pyrogen LPS gramnegativer Bakterien, allerdings weit weniger potent ist.Mycoplasmas form a large group of procaryotic microorganisms that can be distinguished from ordinary bacteria by their small size and their total lack of a cell wall. Diacylated lipopetides from Mycoplasmas act as so called “pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) and stimulate the innate immune system via activation of the “Toll-like receptor” (TLRs) 2/6 heterodimer. This kind of activation results in a number of symptoms of the acute-phase response, such as the formation of proinflammatory cytokines, prostaglandins, and NO, or in the manifestation of fever and sickness behavior. In this study, we investigated the properties of fibroblast-stimulating lipopeptide-1 (FSL-1), which represents the NH2-terminal sequence of a lipoprotein from Mycoplasma salivarium. Central goal was to characterize the pyrogenic properties of FSL-1 in an established in vivo model. Intra-arterial (i.a.) and intraperitoneal (i.p.) injections of FSL-1 caused dose-dependent fevers in guinea pigs, which coincided with elevated plasma levels of TNF and IL-6, the i.p route of administration being more effective than the i.a. route. I.a. or i.p. injection of a soluble form of the TNF type 1 receptor (referred to as TNF binding protein, TNFbp) together with FSL-1 completely neutralized FSL-1-induced circulating TNF, and reduced fever and circulating IL-6. I.a. or i.p. injection of the non-selective cyclooxygenase (COX)-inhibitor diclofenac depressed fever and FSL-1-induced elevations of circulating prostaglandin E2 (PGE2). Circulating TNF and IL-6, however, remained unimpaired by the treatment with diclofenac. Thus, FSL-1-induced fever in guinea pigs is to a high degree mediated by pyrogenic cytokines and cyclooxygenase products. Immunohistochemical detection of nuclear translocation of the transcription factor STAT3 in the brain revealed a direct activation of brain cells in response to treatment with FSL-1(120 min after its systemic administration). The FSL-1-induced and IL-6-mediated genomic activation of brain cells mainly occurred in two target structures: the endothelium of vessels within the entire brain, and endothelial cells and astrocytes in structures with an open blood-brain barrier, e.g., the sensory circumventricular organs such as the area postrema, the vascular organ of the lamina terminalis, and the subfornical organ. Finally, it was investigated if repeated confrontation with FSL-1 in short-term intervals resulted in the development of tolerance to its own effects. With regard to fever, there was a lack of tolerance to repeated i.a. injections, but a transient partial tolerance to repeated i.p. administrations of FSL-1. Endogenous formation of TNF and IL-6 was attenuated in response to repeated stimulation with FSL-1. Cross-tolerance between FSL-1 and LPS was absent in response to i.a. injections. However, repeated i.p. pretreatments with FSL-1 resulted in attenuated LPS-induced effects and vice versa (with regard to fever and cytokine formation). Data on the development of the animals’ body weight indicated that FSL-1 causes anorexia, which is, however, much less pronounced when compared to the anorectic effects of LPS. The results of this thesis clearly document pyrogenic properties of FSL-1 in guinea pigs. In part, the mechanisms responsible for the manifestation of FSL-1-induced fever are similar to those employed by bacterial LPS, the “classic” exogenous pyrogen. The pyrogenic capacity of FSL-1 is, however, less pronounced when compared to LPS