The effect of the potent neutrophil elastase inhibitor CE-1037 on pulmonary vascular resistance and permeability in the isolated recirculatingly perfused and ventilated rabbit lung model after neutrophil mediated respiratory failure

Am Model der isolierten, ventilierten und blutfrei perfundierten Kaninchenlunge wurde der Einfluss des synthetischen, kleinmolekularen, oxidationsresistenten Proteasen-Inhibitors CE-1037 auf die durch intravasale Granulozytenstimulation ausgelöste pulmonale Permeabilitätsstörung untersucht. Die Lungen wurden nach einem standardisierten Verfahren isoliert. Mittels einer elektronischen Wägezelle wurde das Lungengewicht zur Quantifizierung der Flüssigkeitsextravasation kontinuierlich registriert. Gleichzeitig wurde der pulmonal-arterielle Druck über einen elektromechanischen Druckwandler erfasst. Mittels einer Starlingpumpe wurde die Ventilation gewährleistet. Eine Rollenpumpe perfundierte das Lungenpräparat kontinuierlich mit 200 ml pro Minute. Die Kaninchenlungen wurden mit einer Krebs-Henseleit-HAES-Puffer-lösung (KHHB) perfundiert. Humane neutrophile Granulozyten wurden durch eine Dichtegradientenzentrifugation isoliert und je nach Versuchsanordnung eingesetzt. Zur Stimulation der Granulozyten dienten hitzeaggregierte menschliche Immunglobuline der Klasse G. Zur Vermeidung der Einwirkung von vasoaktiven Mediatoren erfolgte die Gabe eines Inhibitor-Cocktails, bestehend aus WEB 2086, Heparin-Natrium (Liquemin®) und Diclofenac-Natrium (Voltaren®). In den zu definierten Zeitpunkten entnommenen Perfusatproben wurde die Elastasen- und Histaminkonzentration gemessen. Für die Vor- und Hauptversuche der vorliegenden Arbeit wurde ein zellfreies Perfusionsmedium verwandt, um die komplexen Einflüsse der verschiedenen zirkulierenden Zellen mit dem Gefäßendothel der isolierten Lunge zu unter-binden und die Interaktionen mit den klassischen humoralen Kaskaden-systemen zu vermeiden. Ohne den Einfluss dieser Faktoren kam es in den Versuchen nach Stimulation der PMN durch hitzeaggregiertes IgG zu einem stark ausgeprägten Lungenödem, quantifiziert durch eine anhaltende Gewichtszunahme bis zum Ende der Versuchsreihe. Als Auslöser dieser Reaktion kommt unter den lysosomalen Proteasen der Granulozyten und Makrophagen vorwiegend Elastase in Betracht. Elastase führt zu einer nicht reversiblen Schädigung der alveolären und kapillären Schrankenfunktion. Eine Schrankenstörung wurde anhand des deutlichen Anstieges des PAP und des Lungengewichts in den Hauptversuchen nachgewiesen. Dagegen traten in der Versuchsgruppe mit CE-1037 keine deutliche, progrediente Lungengewichtszunahme und keine Erhöhung des PAP auf. Die Elastasekonzentration stieg aber wie in der Versuchsreihe ohne CE-1037 an. In den Hauptversuchen wurde eine Reduktion der Histaminkonzentration unter der Zugabe von CE-1037 registriert. Ein möglicher Wirkungsmechanismus ist die Reduktion der alpha-Chymotrypsin (alpha-CH) -induzierten Histaminausschüttung aus Lungenmastzellen. Diese Ergebnisse sind Anlass für weitere experimentelle Arbeiten, um den Pathomechanismus der Hemmung der Histaminausschüttung zu klären. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse führen unter Berücksichtigung der Beobachtungen anderer Autoren zu dem Schluss, dass CE-1037 im in vitro Modell der Kaninchenlunge zu einer deutlichen Hemmung der durch die PMN-Elastase hervorgerufenen irreversiblen Störung der pulmonalvaskulären Schrankenfunktion führt. CE-1037 ist ein hochwirksamer HNE-Inhibitor. Die Ergebnisse legen ebenfalls nahe, dass CE-1037 über die Hemmung von Proteasen zu einer Reduktion der Histaminausschüttung in der Lunge führt.The aim of this study was to investigate the effect of the potent neutrophil elastase inhibitor CE-1037 on pulmonary vascular resistance and permeability in the isolated recirculatingly perfused and ventilated rabbit lung model after neutrophil mediated respiratory failure. The rabbit lung is isolated in a standardized procedure. Rabbits of either sex were anaesthetised and anticoagulated. The trachea was cannulated, and the rabbits were mechanically ventilated by means of a Starling Pump. The thorax was opened via the diaphragm, and after a median sternotomy a catheter was inserted into the pulmonary artery. The lung and heart organ preparation was removed and suspended on weight transducer in a temperature-controlled and humidified chamber. The lungs were perfused by a roller pump at constant-volume inflow of 200 ml/min in a recirculating system containing 200 ml Krebs-Henselein hydroxyethyl starch buffer (KHHB) solution. The lungs were ventilated with 4 % CO2 in air (frequency 45 min-1, tidal volume 25 ml, positive end-expiratory pressure 1,5 cm H2O). Human neutrophils were isolated by centrifugation through a Percoll gradient and infused into the system after stimulation with heat-denaturated class G immunoglobulins. To avoid the influence of vasoactiv substances, the platelet-activating factor (PAF) antagonist WEB 2086, the cyclooxygenase inhibitor diclofenac and the coagulation inhibitor heparin sodium were added to the recirculating system. The pulmonary arterial pressure (PAP) and weight gain as an indicator of extravascular lung water as well as pH were continuously recorded. PO2, PCO2, O2 saturation, oncotic pressure, histamine- and elastasevalues in the perfusate were determined at 30-min intervals. A cellfree perfusion medium was used in the present study in order to avoid the complex interactions with different circulating cells, which may mask direct effects on vascular tone and mediator release. The control-group in the study did not show major changes in vascular resistence or permeability during a period of 4 hours. After PMN-stimulation with heat-denaturated immunoglobulins the pulmonary artery pressure and the lung weigth increased continuously reflecting the formation of interstitial edema. This disturbance of pulmonary vascular permeability is due to a structural, morphological injury of the vessels and alveoli caused by lysosomal proteases, particular elastase from PMN. By the addition of the synthetic, low molecular weight, slowly reversible inhibitor of human neutrophil elastase CE-1037 to the perfusion fluid the edema formation could be suppressed largely. The elastasevalues in the perfusate was determined and increased continuously even under addition of CE-1037. The histaminevalues could also be suppressed by addition of CE-1037. One possible mode of operation might be conditioned by CE-1037 the inhibition of alpha-chymotrypsin induced histamine release in lung mast cells. The results of this study demonstrate in consideration of other authors that CE-1037 suppress largely the human neutrophil elastase mediated respiratory failure in the isolated recirculatingly perfused and ventilated rabbit lung model. CE-1037 is a potent inhibitor of human neutrophil elastase. The results suggest as well that CE-1037 reduce the histamine release throught a different protease inhibition