Molecular and pathomorphologic analysis of the impact of viral proteins of Pseudorabies virus for Neuroinvasion

Alphaherpesviren zeichnen sich in vielen Fällen durch einen ausgeprägten Neurotropismus aus. Die Infektion von Nervenzellen kann nicht nur zu schwerwiegender klinischer Symptomatik führen, sondern steht auch in engem Zusammenhang mit der Latenz dieser Viren. Das Pseudorabiesvirus (PrV) ist ein Alphaherpesvirus, das in zahlreichen Säugerspezies das Nervensystem zielgerichtet infiziert und aufgrund seiner spezifischen Neuroinvasion und transsynaptischen Ausbreitung inzwischen in den Neurowissenschaften einen hohen Stellenwert als Vektor oder Marker für neuronale Leitungsbahnen. Nach oronasaler Infektion von Mäusen zeigte PrV-dUS9 eine mäßig erringerte Neurovirulenz, immunhistologisch jedoch eine in Quantität und Qualität dem Wildtyp ähnliche Infektion von trigeminalen Neuronen. Zusätzlich waren Neurone des ventromedialen Thalamus sowie des sekundären somatosensorischen Kortex infiziert. Die Kinetik der viralen Ausbreitung im trigeminalen System deutet auf eine leicht verzögerte anterograde, transsynaptische Ausbreitungsfähigkeit dieser Mutante zwischen trigeminalen Neuronen erster und zweiter Ordnung hin. Eine EGFP/UL35-markierte PrV-dUS9-Mutante zeigte bei Zeitrafferaufnahmen keine Einschränkungen des axonalen Transports von Kapsiden. Somit ist das US9-Protein offenbar für die anterograde transsynaptische Ausbreitung im oronasalen Infektionsmodell nicht notwendig. Eine weitere Bestätigung dieser Beobachtung lieferte das In-vivo-Verhalten von PrV-dUL11/US9. Diese Mutante zeigte im Mausmodell eine stark verzögerte Neuroinvasion im trigeminalen System, war jedoch fähig, sich anterograd und transsynaptisch auszubreiten. Trotz der reduzierten Neurovirulenz zeigte auch PrV-dUL11/US9 eine Infektion des somatosensorischen Kortex und Thalamus. Die Genprodukte von UL11 und US9 besitzen aus diesem Grund möglicherweise redundante Funktionen während der Replikation und des Transports in Neuronen, so dass die Anwesenheit eines der beiden Proteine für eine effiziente Ausbreitung in neuronalen Systemen notwendig ist. Das UL37-Protein ist notwendig für die Neuroinvasion nach oronasaler Infektion von Mäusen und für den axonalen Transport von Kapsiden in der primären trigeminalen Zellkultur. In kultivierten trigeminalen Neuronen zeigte phänotypisch komplementiertes PrV-dUL37 zwar eine intranukleäre Ansammlung, jedoch keinen axonalen Transport von Kapsiden. Als innerste Schicht des Teguments könnte das UL37-Protein ein wichtiges Bindeglied zwischen viralem Kapsid und zellulären Motorproteinen des schnellen axonalen Transports darstellen. Obwohl PrV-dUL48 in vitro einen ähnlichen Phänotyp wie PrV-dUL37 zeigte, war die Neuroinvasion bei Abwesenheit von UL48 stark verzögert, jedoch nicht blockiert. Zeitrafferaufnahmen in neuronaler Zellkultur zeigten einen uneingeschränkten axonalen Transport Kapsiden dieser Mutante. Die verlängerten Überlebenszeiten sind somit hauptsächlich durch einen Defekt von PrV-dUL48 in der Virusreplikation und nur geringfügig durch Einschränkungen im axonalen Transport von Kapsiden bedingt. Die Deletion von UL16 oder UL21 hatte einen nur mäßigen Einfluss auf die Virulenz der Mutanten. Während das simultane Fehlen beider Proteine in vitro nur eine leichte Reduktion der Zell-zu-Zell-Ausbreitung bewirkte, zeigte sich in vivo eine ausgeprägte Reduktion der Neurovirulenz, nicht jedoch der Neuroinvasion. Der Komplex aus den UL16- und UL21-Proteinen des PrV besitzt somit virulenzbestimmende Eigenschaften in vivo. Die zusätzliche Deletion von UL11 bewirkte keine zusätzliche Einschränkungen der Neurovirulenz. Deletionsmutanten in UL17, UL31, UL34 und UL11/gM waren nicht neuroinvasiv. Deletionsmutanten in UL51 und UL41 zeigten geringgradig verlängerte Überlebenszeiten und leicht reduzierte Neurovirulenz. Dies führt zu der Annahme, dass UL41 keine herausragende Rolle im „Viral Host Cell Shutoff“ des PrV spielt und funktionelle Redundanzen anderer Proteine möglicherweise die Deletion der Gene ausgleichen. Die Genprodukte von UL46, UL3, US3, UL47 und UL13 besitzen nur einen geringen Einfluss auf die Neurovirulenz von PrV.Alphaherpesviren display a distinct neurotropism. Neurons constitute the places for herpesviral latency and their infection may also lead to severe clinic symptoms and. The Pseudorabies Virus (PrV) is an alphaherpesvirus, that specifically infects the neuronal system of a broad range of mammals. Because of its specific neuroinvasion and its transsyaptic spread between connected neurons, PrC is an important vector and marker of neuronal circuits. Some viral structural and nonstructural proteins are essential for infection and replication of PrV in vitro. Other viral proteins, that are nonessential in vitro, might play a role in viral replication in neurons. Besides their involvement in viral morphogenesis and egress they are probably required for intracellular transport. We therefore tested several PrV-deletion mutants for their neurovirulence and the kinetic of their spread in the trigeminal system after oronasal infection of mice. Furthermore, we established PrV-mutants that contained a UL35/EGFP-fusion protein. The intraneuronal transport of these mutants in primary trigeminal cell culture was investigated by time lapse recording. The deletion of the US9 in the PrV-dUS9 mutant did not affect the replication in cultured nonneuronal cells. PrV-dUS9/UL11 had an in vitro phenotype similar to that of PrV-dUL11. In mice, PrV-dUS9 showed a moderately reduced neurovirulence. However, immunohistochemistry revealed an infection of the trigeminal circuit similar to that of wild type PrV. Additionally, neurons of the ventromedial thalamus and the secondary somatosensory cortex were infected. Kinetics of viral spread from first to second order trigeminal neurons suggest a mildly delayed anterograde, transsynaptic spread of this mutant. Laser-scanning confocal time-lapse recording revealed no limitations of axonal transport of PrV-dUS9F capsids bearing multiple copies of the EGFP protein. Therefore, the US9 protein is apparently not essential for anterograde transsynaptic spread to the CNS after oronasal infection. PrV-dUL11/US9K demonstrated a delayed neuroinvasion, it was able to spread anterogradely and transsynaptically. Despite its reduced neurovirulence, PrV-dUL11/US9K infected also the secondary somatosensory cortex and the thalamus. For this reason, UL11 and US9 proteins might possess redundant functions during replication and axonal transport. The presence of either of them is therefore necessary for efficient spread in neuronal systems. The UL37 protein is essential for and for axonal transport. Phenotypically complemented PrV-dUL37 displayed an intranuclear accumulation of capsids in cultured trigeminal neurons. The UL37 protein representing the innermost layer of the tegument, might constitute an important link between the capsid and motor proteins of the fast axonal transport. Further investigations are necessary to finally clarify the function of the UL37 gene product. PrV-dUL48 exhibits an in vitro phenotype similar to that of PrV-dUL37. Nevertheless, neuroinvasion was severely delayed but not blocked due to absence of the UL48 protein. In cultured neurons a mildly decelerated axonal transport of capsids was observed. Therefore, the prolonged survival times of mice are caused mainly by an impaired replication of PrV-dUL48 and only to a lesser extent by delayed axonal transport of capsids. Deletion of the UL16 and UL21 genes had only little influence on the virulence of the mutants. While absence of both proteins reduced only slightly the cell-to-cell spread in vitro, the double deletion mutant showed in vivo a marked no reduction in neuroinvasiveness. Therefore, the UL16/UL21-complex determines virulence in vivo. Additional deletion of the UL11 gene did not further reduce neurovirulence. Deletion mutants in UL17, UL31, UL34 and UL11/gM genes were not neuroinvasive. These results in the mouse model correspond largely with the in vitro phenotype of the respective mutants. Deletion of UL51 and UL41 genes resulted in slightly extended mean survival times and reduced neurovirulence. This leads to the assumption that UL41 alone does not play a central role in viral host cell shutoff and functional redundancies of other proteins might substitute deletion of the genes. The deletion of UL46, UL3, US3, UL47 and UL13 hardly influenced the neurovirulence of PrV. Mutants in these genes displayed wild-type-like mean survival times and pattern of infection in the CNS